ゅ冷世界５２生物技术
２．２形态特征及生理生化性质分析
２００９年１９（２）
色、粉末状半纤维素。
１．２方法
对产蛋白酶的细菌进行形态特征和生理生化检测，结果表明，该细菌Ｇ一、球状。同时实验结果也表明．该细菌对ｐＨ的耐受范围是ｐＨ６．２—７．８，该菌株需盐但不耐盐（２％），最适ｐＨ６．８条件下的耐受温度是５５℃，该细菌不产木聚糖酶、苯丙氨酸脱氨酶和脂酶。
裹１生理生化实验结果
Ｔａｂｌｅ１
Ｒｅｓｕｌｔ
，
１．２．１取样
取样时，应取距水面１０～１５ｅｒａ的深层水样，先将灭菌带塞子的空瓶，瓶口向下浸入水样，然后反转过来，除去塞子，水即流入瓶中盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，立即进行实验。
１．２．２培养基的筛选
无菌操作取吐曼河水样，将水样连续ｌＯ倍梯度稀释后．准确吸取０．２ｍ１分别涂布于牛肉膏蛋白胨、脂酶、苯丙氨酸脱氨酶、蛋白酶和木聚糖酶培养基的平板上，在恒温培养箱中３７℃先正置培养１ｈ后倒置培养２４ｈ，高氏一号和马丁氏培养基在恒温培养箱中２８℃倒置培养２４ｈ，在产酶培养基长产生透明圈者为阳性反应。
１．２．３分离纯化
采用１．２．２选出的培养基，按以上取样、接种及培养方法对在蛋白酶培养基上产生透明圈的细菌进行鉴定。１．２．４１６ＳｒＲＮＡ序列分析
扩增１６ＳｒＲＮＡ基因和序列测定委托大连Ｔａｋａｒａ公司完
ｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
特征
Ｃ，ｎｍｌ１－ｅａ２ｔｉｏｌｌ
ｐＨｐＨ
分离菌株
一
６．０８．０
＋
一一＋
№ａ（Ｏ％）Ｎａａ（２％）ＮａＣＩ（４％）温度５５℃温度６０℃产酸葡萄糖
果糖乳糖甘露醇麦芽糖
糖发酵实验蛋白酶实验脂酶实验木聚糖酶实验苯Ｉ王ｉ氨酸脱氨酶实验
＋
一＋
、，
成，之后登陆ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｈｉｍ．ｎｉｈ．纠网站，进行序列比
对。
Ｔａｋａｒａ公司在作者提供的培养基中挑取细菌于１０ｔａ灭菌水中变性后离心取上清作为模板。反应条件为：９９℃，１０ｍｉｎ；ＰＣＲ扩增时使用ＴａＫａＲａ１６ＳｒＤＮＡＢａｃｔｅｒｉａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＰＣＲＫｉｔ（ＣｏｄｅＮｏ．Ｄ３１０），进行ＰＥＲ扩增目的片段。反应体系（．Ｓ０ｔａ）：变性反应液ｌ脚；ＰＣＲＰｒｅｍｉｘ２５一；Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｎ．１ｅｒ（２０ｐｆＩｎⅢ）０．５皿；ＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｌＩｌｅｒ２（２０ｐ，ｎｏｌ／ｔａ）０．５ｍ；１６Ｓ—ｆｒｅｅＨ２０２３｝ｄ。
反应条件：９４℃５ｍｉｎ１ｃｙｃｌｅ；９４０Ｃｌｍｉｎ，５５℃ｌｍｉｎ，７２℃
１．５ｍｉｎ，３０ｃｙｃｌｅｓ；７２。Ｃ５ｍｉｎ，ｌｃｙｃｌｅｏ
一～＋
．－
一
＋＋
一一
ｖ
注：表中“＋”表示阳性反应。“一”表示阴性反应，“Ｖ”表示可变，“ｗ”表示反应弱。
２．３２．３．１
１６Ｓ
１．２．５细菌的生理生化检测
参照《伯杰氏细菌鉴定手册》峥Ｊ和《芽孢杆菌属》…】，主要依据形态及生理生化特征对分离的纯培养微生物进行分类鉴定。
１．２．６菌株产酶活力测定
将筛选菌种接种至１００ｎｄ种子培养基，于２５℃振荡培养２４ｈ，以５％的接种量接种至１００ｍｌ发酵培养基中，２５℃振荡培养４８ｈ。发酵液于３０００ｒ／ｒａｉｎ离心１５ｒａｉｎ，取上清液，按照Ｆｏｌｉｎ一酚法测定蛋白酶的活力ｕ“１２。。酶活力单位定义为：Ｉｍｌ酶液在４＆Ｃ、ｐＨ６．２条件下，每分钟水解酪蛋白产生ｌ／ｘｇ酪氨酸的酶量为一个酶活力单位（ｕ）。
