食品分析 (9)

当今世界各国，特别是西方发达国家均加强了对国际贸易肉类产品的检测工作，90年代以来，日本多次以中国进口的鸡肉产品中检出抗生素受到日方警告，

欧盟兽医委员会在

2001

年

11

月确定，中国动物饲料中含有欧盟禁用药物，

如几天前在来自中国的褐虾中检验出的氯霉素，也禁止进口中国的动物源

食品。抗生素、激素残留和农药残留一样，已成为当前束缚我国肉类食品

开创新的国际市场的重要因素。因此，近年来，我国对肉品种抗生素、激

素的检测工作已引起了足够重视，例如：我国已对牛奶、猪肉及猪肾脏中

抗生素残留量进行了普查检测，这对揭示我国动物性食品污染有一定意义，同时，也建立了一些快速、灵敏、自动化的检测方法。

目前，我国已把肉中激素残留指标引入出口肉食品的化验项目，今后还要对激素在畜牧业中的使用做出法律规定，并制定有关激素检测的制度。 一、抗生素的测定

抗生素的测定方法主要有以下三大类：

1、微生物测定法：其测定原理是基于抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，因而与临床应用的要求一致，应用较广。主要缺点是费时、测定结果误差较大，常用的是杯碟法。

2、食品分析方法：这类测定方法和下面所述的化学测定方法均是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量。常用的是比色法、荧光分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法等。

3、化学测定方法：多采用滴定法，如用碘量法或硫酸铈滴定法测定青霉素，用亚砷酸盐滴定法测定链霉素或双氢链霉素等。

以下仅介绍两种抗生素的测定方法，以起示范作用。 （一）四环素族类抗生素的测定

分别由不同链丝菌培养液（黑白链丝菌、龟裂链丝菌、金链丝菌等）中提得的四环素（Tetracyclinum）、土霉素(Qxytetracyclinum)、金霉素（Aureomycinum）和去甲金霉素(Demeclocyclinum)，总称天然四环素类；在半合成的四环素类抗生素中，还有强力霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素，总称新四环素类。四环素类为广谱抗生素，主要是抑制细菌的生长繁殖，但较高浓度时也有杀菌作用。 1、理化性质：四环素类抗生素是酸碱两性的晶形物质，能和酸、碱结合而成可溶性盐类，易溶于稀酸、稀碱等，略溶于水和低级醇类，但不溶于醚及石油醚。

期碱性水溶液的活性易被破坏，在酸性水溶液中较稳定，故一般制成盐酸盐。本类抗生素及其盐类在干燥状态下极稳定，除金霉素外，其他各种抗生素的水溶液也相当稳定。

土霉素煮沸15min大部分受破坏，熏烤的破坏力差些；低温对其影响很小。若肉品中有四环素类5～10ppm，加热煮沸后，估计含量可以低于1ppm(WHO,1963)。

2、毒性：四环素类作饲料添加剂时，如超过20ppm时则可能有药物残留。食用组织中残留水平在1ppm时，对人不致引起毒性反应；5～7ppm时，就能引起人的毒性反应。

关于四环素族类抗生素的测定，目前多用微生物测定法及高效液相色谱法。 可用的物理化学方法有：FeCI3比色法、盐酸比色法、紫外分光光度法、荧光法及近年内文献所报道的用流动注射分析法（FIA）。可用于对四环素、土霉素的痕量分析等。

下面以金霉素的测定为例，介绍荧光测定法。 3、金霉素的荧光测定

（1）原理：在弱碱性条件下，加热，则金霉素可转变成有紫色荧光的降解产物，所产生的荧光相当稳定，特别是金霉素浓度较低时。且其荧光强度与金霉素浓度在一定范围内有线性关系，因而可用标准曲线法定量。 重要的测定条件是：

①溶液PH：必须严格要求，因为它直接影响产生荧光的速度和强度，所以测定时必须用PH7.6的磷酸盐缓冲液高度缓冲。 ②反应温度：温度升高，产生荧光物的反应速度加快。在室温下，不能立即反应。操作中采用沸水浴加热5min。

③波长选择：入激发＝350nm, 入发射＝420nm （2）样品处理：

①采样部位：抗生素被机体吸收后，大多通过肾排出体外，肾中抗生素残留机率最高，肾组织抗生素残留状况完全可以代表动物胴体受抗生素污染的程度，因此肾是抗生素检测的敏感组织，常作为采样部位。此外，颈肌是抗生素肌注的主要部位，也是常见的采样部位，该部位抗生素残留的检出，一般可说明商品禽畜在休药期内注射了抗生素。 ②样品待测液的制备：

抗生素存在于机体有两种形式：

a、与组织蛋白结合的形式，大约占摄入量的50～60%。 b、游离的抗生素。

由于抗生素的这两种存在形式，因此样品处理方法不同，测定结果可以相差很多，一般如在样品预处理中采用离子交换树脂分离或经酶解，丙酮沉淀等措施，可以提高对抗生素的检测水平。

具体操作方法如下：

a、固体样品：称取混匀样品50g，置于组织捣碎机中，加200ml盐酸—甲醇溶液（6mol/LHCI与甲醇1：1混合）或盐酸—丙酮溶液，捣碎5～10min；过滤，用50ml盐酸—甲醇溶液分数次洗残渣，洗液合并于滤液中。于水浴上挥去有机溶剂，注入离子交换树脂层析柱中，先用200ml水以150ml/h流速洗柱；再用60%甲醇液90ml洗脱，流速90ml/h，并用甲醇定容至100ml。吸取20ml，于40℃下减压浓缩至干。

B、液体样品：称取混匀样品50g于500ml烧杯中，加入300ml 0.1mol/L柠檬酸缓冲液（PH4.0），搅拌均匀，注入离子交换树脂层析柱中，以100ml/h流速过柱。从“用200ml水以150ml/h流速洗柱”起，按固体样品操作。

其中离子交换树脂可用XDA—2型吸附树脂，使用时用甲醇浸泡20min以上，然后用倾斜法水洗5～6次后备用。

（3）荧光测定：取上述的全部浓缩残渣，加PH7.6的磷酸盐缓冲液2ml溶解，加水10ml混匀，立刻于荧光计上测量荧光强度（激发峰350nm,荧光峰420nm），作为空白值；然后将样品管于沸水浴中加热5min，冷却，并于15～60min内测定荧光强度。样品测定值减去空白值，并于标准曲线上求得金霉素的含量。 （4）标准曲线的绘制：准确吸取金霉素标准溶液（1ug/ml）2.0,4.0,6.0,8.0,10.0ml，分别置于5支试管中，各加水至10ml、加磷酸缓冲液2ml，混匀，按上述样品操作，测得荧光强度。以各管标准液在加热前后测得的数值之差为纵坐标，以其金霉素含量(ug)为横坐标，绘制标准曲线。

（5）计算： 金霉素含量(ug/kg)＝(A/m)×1000

式中：A——从标准曲线上查得金霉素的含量（ug）

m——测定用样品溶液所相当的样品质量（g）

（6）讨论：

①金霉素和Ca2＋离子及巴比妥酸所形成的络合物在紫外光照射下会产生明亮的绿色荧光，其激发峰405nm，荧光峰530nm，此法可用于组织中金霉素及四环素的测定。测定时，先用稀盐酸萃取，加入三氯乙酸—CaCI2溶液及巴比妥酸钠溶液于一萃取液中，以乙酸乙酯萃取所形成的络合物，于530nm处进行荧光测定。 ②四环素、青霉素、链霉素等也可用荧光法测定。四环素经酸处理后成为脱水四环素，再与AI2O3的乙醇溶液反应可得强荧光产物；青霉素本身无荧光，但和α—甲氧基—6—氯—9（β—氨乙基）—氨基氮杂蒽的缩合产物会发生兰绿色荧光，激发峰420nm，荧光峰500nm；链霉素与1,2—萘醌—4—磺酸钠在碱性介质中所生成的产物，在365nm射线激发下发生兰色荧光，在445nm处测量荧光强度，但专一性不高，具有胍官能团的物质会干扰。 ③食品中四环素族抗生素残留量的测定，用HPLC法最为简便，只需用5%HCIO4提取、离心后，再用0.45um滤膜过滤，然后取一定量滤液进样，反相色谱分离，LV检测即可，该法测定灵敏度高，最低检出浓度分别为OTC：0.15ppm;TC：0.20ppm;CTC：0.65ppm，但回收率还有待进一步提高。 二、链霉素的比色测定

链霉素（Streptoycinum）和双氢链霉素（Dihydrostreptomycinum）都属于氨基糖苷类抗生素。其抗菌作用相似，对格兰氏阴性菌的作用比阳性菌强，并对结核杆菌有作用。本类药物的毒性比青霉素类大，可损害第八对脑神经和肾脏。 （一）理化性质：

链霉素为灰色链丝菌的代谢产物，它是一种有机碱，亦可视为多糖类。能与酸结合成盐，故临床上常用气硫酸盐。链霉素碱和链霉素盐类都易溶于水，不溶于有机溶剂中。链霉素盐类的水溶液较稳定，在室温中或PH3~7时较易保存，可保存一周。当室温偏高或PH>8、PH<3时，可使链霉素水解失效；其他物质如葡萄糖、半胱氨酸、维生素C、羟胺等也可破坏链霉素中的醛基，而使链霉素失去抗菌作用；各种氧化剂如高锰酸钾、硝酸钾等，各种还原剂如硫待硫酸钠、磷酸二氢钠等都可使链霉素的抗菌效能减低或消失。链霉素热稳定，经100℃2小时可不受影响；冷冻对其影响也小。

双氢链霉素是将链霉素中链霉糖的醛基加氢还原成醇而得，其理化性质与链霉相似。双氢链霉素没有醛基，因而不受葡萄糖、维生素C等药物的作用，所以较稳定。其水溶液稳定性较链霉素为高。链霉素的效价单位，以重量计算，1g＝100万IU。 （二）毒性：

链霉素和双氢链霉素的毒性均较大，对人体可引起过敏反应、神经系统反应及对肾脏的损害和组织神经肌肉连接点等。

虽然世界卫生组织于1969年规定：乳、肉、蛋中链霉素和双氢链霉素分别达0.2,1.0,0.5ppm时不致对人体引起不良反应，但多数国家仍不允许在乳、肉、蛋中有链霉素和双氢链霉素残留。 （三）比色测定原理：

链霉素与二硝基笨肼在酸性溶液中可反应生成黄色的链霉素二硝基笨腙，多余试剂经乙酸丁酯提取除去后，于430nm波长处测其吸光度，以标准曲线求出样品中链霉素含量。 （四）操作方法： 1、样品处理：

① 固体样品：称取均匀样品50g于组织捣碎机中，加3%三氯乙酸溶液50ml，捣碎5~10min，过滤，滤液备用。

② 液体样品：吸取样品3ml于30ml离心管中，加水10ml及3%三氯乙酸溶液5ml，摇匀，离心分离。

2、绘制标准曲线：准确吸取链霉素标准溶液（10ug/ml）0,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0ml于具塞试管中，加0.5ml 2,4—二硝基笨肼试剂，盖塞，置沸水浴中加热2min,取出用水冷却。用乙酸丁酯提取四次，每次10ml，弃去有机层；水溶液呈黄色。用1cm比色杯，于430nm波长处，以试剂空白（0管）为参比，测定吸光度，并绘制标准曲线。

第一节测定：吸取样品滤液或离心液15.0ml，加0.5ml 2,4—二硝基笨肼试剂，以

下操作同标准曲线绘制。

（五）计算： 链霉素含量（ug/kg或ug/L）＝A×1000/m×(V2×V1)

式中：A——从标准曲线中查得测定用样液中链霉素的含量（ug） m——样品质量或体积（g或ml） V1——样品提取液的总体积（ml） V2——测定用样液的体积（ml） （六）讨论：

1、发色剂需现用现配，配制方法是：0.2g 2,4—二硝基笨肼与1mlH2SO4、5ml 乙醇、1.5ml水混匀，过滤。 2、也可用氨脲比色法，测定时用氯笨偶氮萘氨脲(0.135g氯笨偶氮萘氨脲加50ml二甲氧基乙醇，温热至50℃使之溶解；加2.66gNaAc，溶解后再加入8.3ml冰乙酸，以二甲氧基乙醇稀释至100ml)显色，以氯仿洗去多余的显色剂，并加浓盐酸，于580nm测定吸光度。

3、链霉素和双氢链霉素的化学测定方法很多，如链霉素的氧化亚硝基铁氰化钠法（比色）、亚砷酸盐法（滴定）；双氢链霉素的紫外分光光度法、过碘酸法（比色）、α—萘酚比色法等。

比色法还可用于其他抗生素的测定，如：α—萘酚比色法测定氯霉素的含量，对二甲氨基笨甲醛比色法测定青霉素等。

第二节 激素的测定

一、概述

激素（Hormone）由内分泌和分散在其他器官内的内分泌细胞所分泌的微量生物活性物质，它们有调节、控制组织器官的生理活动和代谢机能的作用。激素在动物和人体内正常时含量甚微，但能量很大，对机体的作用强，影响大。在食用组织中尽管含有微量，一旦进入人体，将对人体产生很大影响。如曾发现残留在猪肉上的“三腺”（即甲状腺、肾上腺和有病变的林巴腺），被人食用后而引起中毒。

常用于食品动物的激素为性激素。性激素具有促进生长发育、增加体重等作用，广泛用于畜牧业生产中，通过饲料添加剂或皮下置入方法而摄入牲畜体内。

残留于肉食品中的性激素，进入人体以后，使体内含量增加。当超过人体正常水平时，通过负反馈使下丘脑产生的GRH和垂体前叶产生的FSH和LH分泌减少，从而破坏了机体的正常生理平衡，而呈现不良后果。经动物实验发现，雌激素（特别是人工合成的已烯雌酚）还有致癌作用。因此，这类激素在食用组织中不允许有残留。有些国家已限制性激素在食品动物上的应用，特别是对生命期短的食品动物如肉鸡等，更应禁止使用。

本节只对性激素加以讨论。 （一）分类：

性激素按其来源可分三类：

（1）天然性激素：由动物性腺分泌的一类甾醇类物质，如由卵巢分泌的雌二醇及其代谢产物雌酮、雌三醇，由卵巢中黄体分泌的孕酮，由睾丸分泌的睾丸酮等，他们的毒性较小，能在肝脏中得到降解。

（2）人工合成性激素：如炔雌醇（仍属类固醇化合物）及以已烯雌酚、已烷雌酚、甲孕酮、已酸孕酮、甲基睾丸素、笨乙酸睾丸素及去氢甲基睾丸素等，他们在体内的吸收、排泄均较缓慢，不易被降解，毒性大（已烯雌酚更是众所周知的致癌物），因此对人极不安全。

（3）植物激素：如玉米赤霉醇及其衍生物，玉米赤霉烯酮等，主要用于育肥。在肝脏中残留水平高，其ADI值为0.5ppb。

（二）性质：性激素从化学结构看，大都具有酚羟基，因而他们均显弱酸性，可与强碱作用（不与Na2CO3作用）成盐而易溶于强碱性水溶液中，利用此性质，可将待测的性激素于其他中性类固醇杂质分离。

不溶于水，溶于有机溶剂。

雌激素在100℃下与硫酸作用，能生成兰色荧光物，因而可用荧光法定量。 雌激素与2,4—二硝基笨肼作用生成在254nm下具特征吸收性质的2,4—二硝基笨腙，因而可用带紫外检测器的高效液相色谱法定量。 （三）卫生标准：

由于我国尚未规定雌激素在食品动物中的限量标准，现将美国规定的食品动物中雌激素的允许残留量，宰前休药期等有关限制规定，列于附录。而雌激素仅能用于培育小母牛或其他家畜，不可用于泌乳牛。用药后，宰前停药时间或清除时间需60天。所有食用组织均不得有药物残留。 （四）检测方法：

关于激素的检测方法，大致可分为以下四类：

1、生物学法：最早由ASTwood于1936年提出，该法是基于性激素置入动物体后，能促进生殖器发育或引起有关组织细胞学的变化，因此可通过观察增重或细