蝶翼天使苗刺激小鼠免疫系统, 1周后,分别于第1、15、30和45d各腹腔注射抗原一次,每次用量011mL (抗原浓度6181mg/mL)。第一次注射时,抗原和等量的完全弗氏佐剂混合均匀,以后各次均和等量的非完全弗氏佐剂混合;
抗血清的分离:从注射抗原后的第15d开始,每隔7d断尾采血样,血样于室温放置23h凝血,然后4℃过夜, 3000r/min离心5min,取血清,测效价,分装后-20e保存备用。
（5）间接非竞争ELISA测抗血清效价：
抗原包被:用011mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲溶液稀释三聚氰胺-OV复合物(三聚氰胺-OV是三聚氰胺与卵清白蛋白的复合物,制法同三聚氰胺-BSA)至10Lg/mL,每孔100uL包被40孔微孔, 4℃过夜至恢复至室温,倾去包被液, PBST (0105% Tween20pH712 0.1mol/L磷酸缓冲溶液生理盐水)满孔洗涤三次,每次5min,扣干;
封阻:每孔200LL 5%脱脂奶(溶于PBST), 37℃保温保湿2h至恢复至室温,倾去封阻液, PBST满孔洗涤3次,每次5min,扣干;
抗原抗体反应:每孔加入100uL以PBST倍比稀释的抗血清和阴性血清,同时以PBST代替血清作为空白对照, 37℃保温保湿2h至PBST洗涤扣干3次;
酶标二抗与抗体抗原复合物反应:每孔100uL的羊抗鼠IgG: HRP酶标二抗(以PBST作1B1000稀释), 37℃保温保湿1h至PBST洗涤扣干5次;
底物显色反应:每孔加反应底物100uL(40mg邻苯二胺溶100mL pH510 0.1mol/L的柠檬酸)0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液,再加入150uLH2O2,现配现用),37℃避光反应30min,每孔50LL 2mol/LH2SO4终止反应, 5min后以空白对照孔调零, 490nm测吸光值。以抗血清的吸光值两倍于阴性血清的吸光值时,抗血清的最大稀释倍数作为抗血清的效价。 （6）抗血清特异性分析：
抗原包被、封阻、酶标二抗与抗体抗原复合物反应及底物显色反应操作均同（5）,不同之处是在第三步抗原抗体反应中,每孔加倍比稀释的竞争抗原10uL (参试抗原分别为氰脲酸、三聚氰酸酰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰胺),同时加入以PBST适当稀释的抗血清90uL混匀,37℃保温保湿1h。设置空白对照及阳性对照,空白对照以100uL的PBST代替90uL抗体+10uL的竞争抗原;阳性对照为100ul的抗体,不加竞争抗原。
竞争抑制率(% ) =[有竞争抗原孔的OD490值/阳性对照孔OD490值]×100竞争抑制率超过10%即初步表明该血清有特异性反应。 （7）牛奶中三聚氰胺的加标回收：
将不同浓度的三聚氰胺标准品添加到不含三聚氰胺的牛奶样中,使样品中的三聚氰胺含量分别为0.1ug/mL, 1ug/mL, 10ug/mL, 100ug/mL, 500Lg/mL和1000Lg/mL,然后利用自制抗体间接竞争ELISA分析三聚氰胺含量,计算其回收率。
13.4 牛奶中三聚氰胺的ELISA加标回收
将不同浓度的标准三聚氰胺添加到不含三聚氰胺的奶样中,间接竞争ELISA分析三聚氰胺含量以研究其回收率,每个浓度重复6次,结果如表11.1。
表11.1 三聚氰胺加标回收实验的测定结果
编号 0.1ug/mL 1ug/mL 10ug/mL 100ug/mL 500ug/mL 1000ug/mL 1 70.30 84.26 101.40 75.50 103.20 100.39 2 89.26 96.50 97.39 100.49 99.43 99.45 3 88.02 88.98 94.96 83.71 98.60 90.06 4 95.82 90.46 90.38 91.39 92.94 89.08 5 90.33 89.26 86.46 72.86 113.59 87.15 6 87.79 80.05 90.08 87.60 106.90 90.08 X 86.92 88.25 93.45 85.26 102.44 92.70 CV 9.96 6.36 3.22 12.02 6.80 6.15
14 荧光光谱法水相测定
14.1 原理
在水介质中,三聚氰胺与荧光素钠缔合,使体系的荧光强度增强,从而建立三聚氰胺的测定新方法。 14.2 仪器与试剂
荧光分光光度计 精密酸度计 分析天平
电热恒温三用水箱
三聚氰胺
50 mg/L荧光素钠溶液。 14.3 实验方法
于5 ml比色管中依次加入50 mg/L荧光素钠溶液0.3ml适量三聚氰胺标准应用液,用水定容,摇匀, 30e静置5 min后,于荧光分光光度计上以493 nm为激发波长, 514 nm为测定波长,狭缝Sex=5 nm /Sem=3 nm,分别测定试剂空白的荧光强度F0和标准系列中其它溶液的荧光强度F,计算荧光强度差值。绘制标准曲线,建立线性回归方程。标准曲线法定量测定样品中的三聚氰胺含量。在HitachiF-4500型荧光光谱分析仪上测定三维荧光光谱。
激发光源: 150W氙弧灯; PMT电压: 400 v;狭缝Sex=5 nm /Sem=5 nm;扫描速度: 1200 nm /min;Kex=400~650 nm,Kem=400~650 nm。
15 基于反相液相色谱-质谱联用的高灵敏度三聚氰胺检测
15.1 原理
采用一种质谱兼容离子对试剂: 七氟丁酸 (HFBA), 可以使三聚氰胺在反相液相色谱上被保留和分离, 且不干扰质谱的在线检测. 采用内标法和多反应监测方法进一步增强了定量的准确性. 基于这一策略,对三聚氰胺检测方法的定量限达到 0.1 ng/g(ppb), 在液态奶中的定量限达到 8 ng/g, 在固体奶粉中的定量限达到 15 ng/g。 15.2 试剂与材料
甲醇
七氟丁酸 三氯甲烷
三聚氰胺标准品纯度≥99%, 稳定同位素三聚氰胺标准品 奶粉
15.3 奶粉样品处理
精确称取 25 mg 奶粉样品于 1.5 mL 塑料离心管中,加入 1 mL 1%HFBA 溶液, 0.25 mL 甲醇和 2.5 μL 稳定同位素三聚氰胺内标储备液, 振荡提取 5 min, 再超声提取 10 min 后, 12000 r/min 离心 5 min. 取上层清液700 μL 转入 1.5 mL 离心管中, 加入 100 μL 三氯甲烷振荡混合 3 min 后, 12000 r/min 离心 5 min, 取上层清液 200 μL 经 0.22 μm 超滤离心后, 供质谱测定。 15.4 质谱 MRM 扫描参数
化合物 ： 三聚氰胺 母离子质荷比(m/z)： 127 产物离子质荷比(m/z)： 85 驻留时间/ms： 300 毛细管出口电压/V： 100 碰撞能量/V ： 20 15.5 重复性和回收率
图15.1显示了三聚氰胺标准品和同位素内标的MRM 色谱图的重复性. 以 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20ng/mL 的 7 个三聚氰胺标准工作溶液进样, 三聚氰胺标准品平均保留时间为 4.201 min, 相对标准偏差(RSD)值为 0.40%, 同位素内标平均保留时间为 4.200 min, RSD 值为 0.41% 。 说明实验中色谱分离的重复性理想. 标准品和同位素内标的色谱行为一致。
图15.1
图15.2显示阴性对照奶粉进行加标回收5次的三聚氰胺 MRM 色谱图, 在 5 份 25 mg 阴性对照奶粉样品中, 平均加标回收率为 99.4%, RSD 值为 1.87%.说明方法的回收率和稳定性均达到较好水平。
图15.2
加标回收实验结果
样品序号 阴性对照奶粉 阴性对照奶粉添加 理论三氰胺 实测三聚氰胺含量 回收率(%）
??
质量/mg 三聚氰胺质量/ng 含量/ng·g1 /ng·g1
1 25 12.5 500 492.57 98.51 2 25 12.5 500 508.43 101.67 3 25 12.5 500 494.92 98.97 4 25 12.5 500 503.35 100.66 5 25 12.5 500 484.71 96.94
16 紫外分光光度法
16.1 原理
利用三聚氰胺的甲醇溶液在203 nm 波长处有最大吸光度，建立了紫外分光光度法直接测定三聚氰胺的新方法。 16.2 仪器与试剂
紫外可见分光光度计 甲醇水溶液 甲醇 三聚氰胺 16.3 实验方法
取一支 10 mL 具塞比色管，其中加入适量的合成样品，以甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，以甲醇水溶液为参比，使用 1 cm 石英比色皿在 203 nm 波长处测定吸光度 A 值。平行测定三次，取平均值。
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