蝶翼天使1 2 3
0.4 0.8 1.6 0.413 0.788 1.579 103.2 98.5 98.7 1.3 0.7 1.1 7 表面解吸常压化学电离质谱法
7.1 实验原理
由于三聚氰胺呈碱性,在正离子模式下易质子化形成[M+H]+的分子离子,因而在质谱中获得很强的信号峰(m /z127)。选择m /z127分子离子峰进行二级质谱研究,主要得到特征离子m /z110,85,68和60(如图2所示),分别为母离子丢失NH3、NH2CN、NH2CN及NH3、HNCNCN所致,另外,二级质谱碎片离子m /z85的三级质谱中,可产生m /z68的碎片离子,为二聚氰胺质子化离子进一步丢失NH3所致。为了确保结果的可靠性,实验还采用ESI-MS方法对三聚氰胺进行了MS/MS谱对照分析,,并且通过氘代三聚氰胺的SDAPCI-MS/MS谱图对有关特征离子的结构式(如图2及图3所示)进行了确认。如果在实际样品中能够检测到信号峰m /z127,并且在MS/MS谱中观察到主要特征离子m /z110、85(基峰)、68和60,则可以判断该样品中含有三聚氰胺,如图3所示。
7.2 仪器与试剂
SDAPCI离子源:如图1所示。LTQ-XL型线性离子阱质谱仪。三聚氰胺,使用时配置成100. 0 mg/kg水溶液备用;奶粉样品。
7.3 实验方法
线性回归方程建立：
配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0 mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取
100uL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中,按前述实验方法进行SDAPCI-MS实验。 7.4 数据处理
将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m /z85的净响应信号强度表示,每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差。信号强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。在0. 01~100 mg/kg范围内,离子强度的对数(Y)与浓度的对数(X)具有较好的线性关系。对0. 10 mg/kg标准样品进行测定,获得净响应信号强度为72(n=6)。本方法三聚氰胺的检出限为8. 8Lg/kg。
7.5 线性范围、检出限、回收率和精密度
配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0 mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取100LL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中,按前述实验方法进行SDAPCI-MS实验。将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m /z85的净响应信号强度表示,每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差(括号内)依次为: 58(9.2% )、72(3.9% )、98(5.6% )、145(8.3% )、205(5.8% )。信号强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。在0. 01~100 mg/kg范围内,离子强度的对数(Y)与浓度的对数(X)具有较好的线性关系。线性回归方程Y=0.1402X+2.0168,相关系数r=0. 990。
对0. 10 mg/kg标准样品进行测定,获得净响应信号强度为72(n=6),并测得空白样品的3倍标准偏差为6. 336(S/N=3, n=20),计算得本方法对三聚氰胺的检出限为8. 8Lg/kg。
回收实验时,在9份0. 1 g奶粉样品中, 3份加入100LL水, 6份分别加入100LL 1. 0 mg/kg和5.0 mg/kg(各3份)三聚氰胺的标准溶液,按照实验方法进行测定。获得样品中三聚氰胺含量为2. 2 mg/kg(n=6),加标回收率分别为: 93. 1%、105. 4%、112. 8%、97. 5%、86. 7%、10312%。这可能是由于手动进样时的不稳定性(如抖动等原因)和样品表面不均匀性造成的,如果采用自动进样则可能克服此问题,进一步提高其分析性能。
8 超高效液相色谱-串联质谱法
8.1原理
三聚氰胺是一种弱碱性化合物,微溶于冷水,可溶于甲醇、乙腈、甲醛、乙酸、三氯乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。本实验以含5%乙酸铅的三氯乙酸的溶液做为提取液,能够有效沉淀样品基质中的蛋白。样品经过甲基叔丁基醚的液液萃取,能有效地除去基质中的油脂。采用混合阳离子交换固相萃取柱能进一步除去样品基质干扰,提高方法的回收率及灵敏度。 8.2 实验仪器与试剂
Agilent1200超高效液相色谱仪 离心机
涡旋混合器 固相萃取仪 氮吹仪
乙腈(HPLC级),甲醇(HPLC级),乙酸铵(HPLC级),超纯水,三聚氰胺标准品(纯度>99%),三氯乙酸(分析纯),乙酸铅(分析纯),氨水(分析纯),水(超纯水), PCX混合阳离子交换柱(60 mg/3 mL)。三聚氰胺标准储备液(1 mg/mL),三聚氰胺
标准工作液(5Lg/mL)。三聚氰胺标准溶液(1~1000 ng/mL)。 8.3 实验步骤 样品提取：
准确称取2.0±0.01 g待测样品于50 mL离心管中,加入20 mL提取液(含5%乙酸铅的三氯乙酸溶液),液体样品加提取液定容至20mL,涡旋2 min,超声提取25 min,静置2 min,10000 rPmin离心10 min。 样品净化：
将离心液倒入装有20 mL甲基叔丁基醚的分液漏斗中,剧烈震荡2 min,静置10 min,收集下层液。分别用3 mL甲醇, 3 mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱,准确移取10 mL收集液分次上柱,控制过柱速度在1 mLPmin以内,再用3 mL水和3 mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱,抽近干后用3 mL氨化甲醇(V(氨水)BV(甲醇)=5B95)洗脱,收集洗脱液于50e氮吹下吹干。精确量取90%乙腈1 mL溶解残留物,涡旋1 min,过0.45Lm滤膜,上机测试。 8.4 方法的线性范围和检出限
分别配制浓度为1, 10, 50, 100, 200, 500,1000 ngPmL的三聚氰胺标准溶液,在此范围内考察该方法的线性,以浓度与峰面积的对应关系,绘制标准曲线,线性方程为y= 1519110x-2413492,R2=019998,线性关系良好。以信躁比3：1确定检出限为0.101 mg/kg。 8.5 方法的回收率和精密度
以空白样品为测试样品,加标水平在10, 30,45ug/kg上。在相同的条件下每个水平做4个平行,回收率及相对标准偏差见表4.1。
表4.1 回收率和精密度实验(n=4) 化合物 加入量/(Lg/kg) 测定量/(Lg/kg) 回收率/% RSD/% 10 8.1 7.9 8.5 6.9 78.5 8.6 三聚氰胺 30 25.2 24.3 26.8 27.4 86.5 5.5 45 41.3 43.2 42.4 39.8 92.6 3.5
9 高效毛细管电泳法
9.1 原理
三聚氰胺呈弱碱性(pKb=8),在酸性环境下带正电荷,选择在pH2.6的环境下分离。
9.2 仪器、试剂与材料
毛细管电泳仪 高速冷冻离心机 pH计。 三氯乙酸、柠檬酸(Cit)、Na2HPO4、甲醇。三聚氰胺标准品(纯度大于99% )。用甲醇溶液溶解三聚氰胺标准品,配成500mg/L的储备液。用甲醇溶液稀释储备液,配制成质量浓度分别为1,5,10,20,40,50,80,100mg/L的工作液。奶粉。 9.3 样品前处理
奶粉的前处理方法
称取2g奶粉样品,加入20mL2%三氯乙酸,涡旋1m in,超声20m in,于9000r/m in速率下离心5min。取10mL上清液过MCX小柱,(预先用3mL甲醇、3mL水活化)。分别用3mL水和3mL甲醇洗涤,抽干SPE柱,用4mL5%氨化甲醇(5mL氨水和95mL甲醇混匀)洗脱,收集洗脱液,并于50℃下用氮气吹干。残留物中加入500uL甲醇溶液复溶,过滤后上机测定。 9.4 电泳条件
毛细管(有效长度50cm,内径75Lm);分离电压25kV;温度25℃;进样3.5kPa(35mbar)*8s;检测波长232nm。使用前依次用0.1moL/LNaOH冲洗5m in、超纯水冲洗5m in、缓冲溶液冲洗20m in;两次进样间用缓冲溶液冲洗3min。 9.5 数据处理
在1~100mg/L范围内,三聚氰胺的峰面积(Y)与质量浓度(X,mg/L)之间呈线性相关，求出线性回归方程，带入求的三聚氰胺含量。 9.6 方法的准确度和精密度
在空白牛奶和奶粉样品中添加三聚氰胺工作液,牛奶的添加水平为0.5,20和50mg/kg;奶粉的添加水平为1.0,20,50mg/kg,每个添加水平测定5个平行样,计算回收率和日内测定的相对标准偏差(RSD);连续测定3d,计算日间测定的RSD,结果见表5.1。
表5.1 牛奶和奶粉中添加的三聚氰胺的回收率及日内、日间测定的RSD 样品 添加量/(mg/kg) 回收率/% 日内RSD /% (n=5) 日间RSD /% (n=3) 0.5 97.0 2.1 2.1 牛奶 20 94.4 3.0 3.9 50 91.4 3.0 2.4 1.0 77.1 2.6 3.1 奶粉 20 73.8 2.8 3.6 50 73.1 3.6 3.6
10 金纳米粒子作探针共振瑞利散射光谱法测定牛奶中三聚氰胺
10.1 原理
在PBS缓冲体系中, 金纳米粒子与三聚氰胺形成粒径较大的聚集体, 导致共振瑞利散射(RRS)强度显著增强, 在一定条件下, 散射强度(ΔIRRS)与三聚氰胺浓度成正比, 由此建立了以金纳米粒子作光谱探针检测鲜牛奶中三聚氰胺的新方法. 在优化的实验条件下, 当三聚氰胺的浓度为 3.3×10－8～4.7×10－7 mol/L 时, 其线性关系为: ΔIRRS＝106.98C－28.279, R2＝0.9971, 检出限为 2.7×10－8mol/L. 本方法金纳米粒子无需修饰, 在体系中仅加入一定量的单链寡聚核苷酸(T10), 实验表明该方法具有简便、快速、灵敏度高及选择性好等特点。
10.2 试剂与仪器 试剂
柠檬酸三钠、氯金酸、三聚氰胺、Na2HPO4?12H2O、NaH2PO4?2H2O、乙腈、正己烷、三氯乙酸, 系列单链寡聚核苷酸, 碱基均为胸腺嘧啶。
仪器
荧光分光光度计 紫外可见分光光度计 电子天平 酸度计
微量离心机 高速离心机 旋转蒸发器 10.3 实验过程
配制金纳米溶液、三聚氰胺(Melamine)标准工作液 共振散射光谱测定：
在 1000 μL EP 管中加入 50 μL, 5.0×10－6mol/L 寡聚核苷酸 T10(以
－5
0.3 mol/L PBS, pH＝7.4 缓冲溶液配制)及 50 μL 三聚氰胺标准溶液(10～10－7mol/L). 静置孵化 15 min 后加入 500 μL, 1.72×10－9mol/L 金纳米溶液.利用荧光分光光度计对反应体系的共振散射光谱扫描.设定的激发与发射波长相同(Δλ＝0), 激发狭缝和发射狭缝宽度均为 5 nm, 扫描范围为 220～800 nm, 灵敏度设置为低档, 根据所记录570nm处的散射光强度, 进行结果分析。
10.4 牛奶中的测定
取按国标法制备的样品储备液, 按以上优化的实验条件, 采用标准加入法检验方法检测三聚氰胺的回收率和相对标准偏差(RSD), 结果列于表6.1。
表6.1 牛奶中三聚氰胺的测定结果(n＝5) 样品 加入量/(10－7mol/L) 测定值/(10－7mol/L) 回收率/% RSD/% 1 0.625 0.664 106.2 1.9 2 0.833 0.805 96.6 5.1 3 1.040 0.962 92.4 4.2 4 2.080 1.920 92.1 2.5 5 4.170 4.180 100.2 3.3 实验结果表明, 本方法有较好的准确度和精密度,回收率分别为 92.1%～106.2%, RSD 在 1.9%～5.1%, 且样品前处理简单, 分析时间短, 不需使用大型仪器, 可用于牛奶样品中三聚氰胺的快速检测。
11 微波消解-流动注射化学发光法测定奶粉中的三聚氰胺
11.1 原理
根据Cr3+对 luminol-H2O2化学发光体系的线性催化作用，首次将
K2Cr2O7在强酸性介质中被有机物三聚氰胺还原成Cr3+的反应与 luminol-H2O2- Cr3+化学发光反应偶合，并结合微波程序消解高效前处理技术和流动注射分析技术，建立了一种灵敏、准确、成本低廉的测定乳粉中三聚氰胺的新方法。 11.2 实验仪器
离子分析仪 电子天平
石英亚沸高纯水蒸馏器
