蝶翼天使三聚氰胺的性质及检测方法
2011级食工一班 郭佳 170112011011
1 三聚氰胺的理化性质
三聚氰胺（英文：Melamine）分子式为C3H6N6,分子量为126. 12,俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为白色单斜晶体,无毒、无味,不可燃烧,可溶于甲醇、甲醛、乙酸、甘油及吡啶等,微溶于水、乙醇,不溶于苯、乙醚、四氯化碳。相对密度为1. 573g/cm3,熔点为354℃高温下可分解产生含氢化氰、氮氧化物和氨等有毒和刺激性的烟雾。
三聚氰胺呈弱碱性,在中性或弱碱性环境下能与甲醛缩合形成各种羟甲基三聚氰胺,但在微酸性(pH值5. 5~6. 5)环境下,可以与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。另外,三聚氰胺三种同系物:三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺。
三聚氰胺是一种用途十分广泛的有机化工原料，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。
三聚氰胺部分物理性质： 熔点(℃)：>300（升华） 相对密度（水=1）：1.573 相对蒸气密度（空气=1）：4.34 饱和蒸气压(kPa)：6.66 水中溶解度(20℃)：0.33g
2 三聚氰胺的毒性
动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害,膀胱、肾部出现结石,并可进一步诱发膀胱癌对于肾脏，短期高浓度接触后会引起肾结石、急性肾衰，长期接触还会造成肾脏组织损伤。。三聚氰胺同系物具有三聚氰胺一样的毒性效
应,很多研究都将它们作为三聚氰胺复合物(MCs)进行总体毒理学评价。
3 第一法 高效液相色谱法（HPLC）
3.1 原理
试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。 3.2 试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
甲醇 乙腈 氨水
三氯乙酸 柠檬酸
辛烷磺酸钠 甲醇水溶液
三氯乙酸溶液（1％） 氨化甲醇溶液（5％） 离子对试剂缓冲液 三聚氰胺标准品 三聚氰胺标准储备液 阳离子交换固相萃取柱 定性滤纸 海砂
微孔滤膜 氮气
3.3 仪器和设备
高效液相色谱（HPLC）仪 分析天平 离心机
超声波水浴 固相萃取装置 氮气吹干仪 涡旋混合器 具塞塑料离心管 研钵
3.4 样品处理 3.4.1 提取
3.4.1.1 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
称取2 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5 mL 乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL水混匀后做待净化液。 3.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
称取2 g（精确至0.01 g）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4倍～6倍）研磨成干粉状，转移至50 mL具塞塑料离心管中，用15 mL三氯乙酸溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入5 mL乙腈，余下操作同3.4.1.1中“超声提取10 min，加入5 mL水混匀后做待净化液”。 注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。 3.4.2 净化
将3.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后 ，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4 g样品）用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供HPLC 测定。 3.5 高效液相色谱测定 3.5.1 标准曲线的绘制
用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为 0.8、2、20、40、80 μg/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC 色谱图参见附录 A 中的图A1.
3.5.2 定量测定
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。 3.5.3 结果计算
试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得： A × c × V×1000 X= × f ????????（1） As× m×1000 式中：
X —— 试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； A —— 样液中三聚氰胺的峰面积；
c —— 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V —— 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； As —— 标准溶液中三聚氰胺的峰面积； m —— 试样的质量，单位为克（g）； f —— 稀释倍数。 3.6 空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。 3.7 方法定量限
本方法的定量限为2 mg/kg。 3.8 回收率
在添加浓度2 mg/kg～10 mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。 3.9 允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
4 第二法 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）
4.1 原理
试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证 ，外标法定量。 4.2 试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
乙酸。 乙酸铵。
乙酸铵溶液（10 mmol/L）：准确称取 0.772 g 乙酸铵于1 L 容量瓶中， 用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
其他同3.2。 4.3 仪器和设备
液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 其他同3.3。 4.4 样品处理 4.4.1 提取 奶粉
称取1 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液和2 mL 乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化液。
4.4.2 净化
将4.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后 ，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于1 g试样）用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后 ，供 LC-MS/MS 测定。 4.5 液相色谱-质谱/质谱测定 4.5.1 标准曲线的绘制
取空白样品按照 4.4 处理。用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以定量子离子峰面积- 浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品 LC-MS/MS 多反应监测质量色谱图参见附录 A 中的
图 A.2。
4.5.2 定量测定
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。 4.5.3 定性判定
按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在三聚氰胺。
表1 定性离子相对丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%至 50% >10%至 20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 4.5.4 结果计算 同3.5.4。 4.6 空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。 4.7 方法定量限
本方法的定量限为0.01 mg/kg。 4.8 回收率
在添加浓度0.01 mg/kg～0.5 mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。 4.9 允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
5 第三法 气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）
5.1 原理
试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。 5.2 试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
