番茄叶霉病菌异菌脲抗药性突变体的诱导与生物学性状

农药学学报　2008,10(3):3032310

C h inese J ourna l of Pesticide Science

?研究论文?

番茄叶霉病菌异菌脲抗药性突变

体的诱导与生物学性状

张传清31,2,　马忠华2,　朱国念2

(1.浙江林学院农业与食品科学学院,杭州311300;2.浙江大学农业与生物技术学院,杭州310029)

摘　要:测定了苯并咪唑类杀菌剂敏感2乙霉威抗性(B en S2D ie R)、苯并咪唑类杀菌剂抗性2乙霉威敏感(B en R2D ie S)和苯并咪唑类杀菌剂抗性2乙霉威抗性(B en R2D ie R)3种类型的番茄叶霉病菌

C ladospo rium fulvum菌株对不同类型药剂的敏感性。结果表明,蕃茄叶霉病菌对供试药剂的敏感

性与其对苯并咪唑类杀菌剂及乙霉威的敏感性无关。根据药剂对3类菌株EC

值的平均值,

50 16种杀菌剂抑制菌丝生长的活性依次为腐霉利>乙烯菌核利>异菌脲>戊唑醇>百菌清>嘧霉胺>醚菌酯>代森锰锌>82羟基喹啉铜>丙环唑>苯醚甲环唑>嘧菌酯>灭锈胺>烯酰吗啉>烟酰胺>三唑酮;抑制孢子萌发的活性依次为醚菌酯>腐霉利>百菌清>乙烯菌核利>灭锈胺>82羟基喹啉铜>异菌脲>代森锰锌>嘧菌酯>烟酰胺>嘧霉胺>戊唑醇>丙环唑>苯醚甲环唑>三唑酮>烯酰吗啉。通过紫外诱变共获得17株抗异菌脲突变体,突变频率为4.5×10-7。其中低抗、中抗和高抗菌株分别占17.65%、70.59%和11.75%。这些突变体对腐霉利和乙烯菌核利表现交互抗性,对苯并咪唑类、脱甲基抑制剂(DM Is)、Q oIs等药剂的敏感性与亲本菌株之间没有显著性差异,与亲本菌株在生长、产孢、致病能力等方面也无显著差异,但对渗透胁迫的敏感性要显著高于亲本。

关键词:番茄叶霉病菌;杀菌剂筛选;异菌脲;抗药性突变体

中图分类号:S481.4　　　　文献标志码:A　　　　文章编号:100827303(2008)0320303208　

I nducti on and Character i za ti on of I prod i one2resistan t M ut an ts

of C ladosporium fu lvum

ZHAN G C huan2qing31,2,　M A Zhong2hua2,　ZHU G uo2n ian2

(1.C ollege of Agriculture and Food Science,Zhejiang Forest U niversity,H angzhou311300,C hina;

2.C ollege of Agriculture and B iotechnology,Zhejiang U niversity,H angzhou310029,C hina)

Abstract:Sensitivity of th ree p henotyp es of C ladosporium fulvum iso lates,nam ely benzi m idazole sensitive2diethofencarb resistant(B en S2D ie R),benzi m idazole resistant2diethofencarb sensitive(B en R2

D ie S)and benzi m idazole resistant2d iethofencarb resistant(B en R2D ie R),to differen t classes of fungicides

w as deter m ined.The resu lts show ed that there w as no relationship bet w een the sensitiv ity of C.fulvum to benzi m idazole,d iethofencarb and to other fungicides.A ctivity of m ycelial grow th inh ibition of the16 fungicides against C.fulvum w as p rocym idone>vinclozolin>ip rodione>tebuconazole>chlorothalonil> pyri m ethanil>kresoxi m2m ethyl>m ancozeb>82hydroxyquinoline copper(Ⅱ)salt>p rop iconazol>

　收稿日期:2008203219;修回日期:2008204223.

　作者简介:3张传清(19772),男,湖北人,通讯作者(A uthor for correspondence),博士,讲师,从事杀菌剂毒理学与抗药性研究.联系电话: 0571263742089,E2ma il:cqzhang9603@12ced01da58da0116d1749ad

　基金项目:浙江林学院发展基金(2351000791)资助.

difenoconazo le>azoxystrobin>m ep ronil>di m ethom or p h>boscalid>triadi m efon.A ctivity of spo re ger m ination inhibition w as kresox i m2m ethyl>p rocym idone>chloro thalonil>vinclozolin>m ep ronil> 82hydroxyquinoline copp er(Ⅱ)salt>ip rodione>m ancozeb>azoxystrob in>boscalid>pyri m ethanil >tebuconazole>p rop iconazol>difenoconazole>triadi m efon>di m ethom orph.A total of17 i p rodione2resistant m utants w as iso lated th rough UV irradiation w ith a m u tation frequency of4.5×10-7.Am ong them,the percentage of low level resistant m utants,m oderate level resistant m utants,and high level resistant m utan ts w as17.65%,70.59%and11.75%,respectively.A ll m utants show ed cross2resistance to p rocym idone and vinclozolin.N o significant difference in sensitiv ity w as detected bet w een these m utants and their parent to other fungicides such as benzi m idazoles,DM Is and Q oIs. There w as no sign ificant difference in grow th,sporu lation and pathogenicity bet w een m utants and their paren t too.H ow ever,these m utants w ere m ore sensitivity to osm otic stress than their parent.

Key words:C ladosporium fu lvum;fungicide screen;ip rod ione;fung icide resistant2m utants

　　番茄叶霉病是为害番茄的一种世界性病害。我国华北、东北地区发病较重,20世纪80年代以来,随着设施栽培的推广,该病的发生越来越广。番茄叶霉病菌C ladosp o rium fu lvum主要为害叶片,多在番茄生长的中后期发生。由于该病菌生理小种组成复杂,变异速度快,极易导致抗病品种抗病性的丧失[1]。长期以来,该病一直以化学防治为主。我国只有以甲基硫菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂登记用于该病的防治,由于药剂的长期单一使用,该病菌已对其产生了严重的抗性。王美琴等的研究表明,山西晋南地区多菌灵抗性频率达97.4%,多菌灵2乙霉威双重抗性频率达49.2%[2]。笔者前期的研究表明,浙江、江苏地区设施番茄叶霉病菌对多菌灵的抗性也达71.9%,多菌灵2乙霉威双重抗性频率达64.7%[3]。

目前鲜有针对抗药性叶霉病进行药剂治理的系统研究。生产上仍继续使用苯并咪唑类杀菌剂,但防治效果差,不仅带来了严重的经济损失,更造成了环境和农产品的污染。本研究在对防治抗药性番茄叶霉病菌的药剂进行全面筛选的基础上,通过紫外诱导获得了其异菌脲抗性突变体并描述了其生物学性状。

1　材料与方法

1.1　供试菌株及其培养条件

3株叶霉病菌C ladosporium fulvum为2006年采自浙江杭州设施番茄的单分生孢子菌株,在4℃下保存于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面上。其中C F223为苯并咪唑类杀菌剂敏感2乙霉威抗性(B en S2D ie R),C F218为苯并咪唑类杀菌剂抗性2乙霉威敏感(B en R2D ie S),C F212为苯并咪唑类杀菌剂抗性2乙霉威抗性(B en R2D ie R)[3,4]。

1.2　供试药剂

50%烟酰胺水分散粒剂(bosca lid W G)由巴斯夫(中国)提供,93%嘧菌酯原药(azoxystrob in)由先正达公司提供,98%代森锰锌(m ancozeb)、98%醚菌酯(k resox i m2m e thy l)、95%百菌清(ch lo ro2 thalon il)、98%多菌灵(carbendazi m)、98.1%腐霉利(p rocym idone)、96%乙烯菌核利(v inclozo lin)、96%异菌脲(i p rod ione)、95.2%乙霉威(d ietho2 fencarb)、95%三唑酮(triad i m efon)、98%戊唑醇(tebuconazole)、95%苯醚甲环唑(difenoconazole)、95%丙环唑(p rop iconazo le)、95%烯酰吗啉(d i m e tho2m o rp h)和98%嘧霉胺(p y ri m e than il)原药均由农业部农药检定所提供,95%灭锈胺(m ep ron il)和95%82羟基喹啉铜(82hyd roxy2 qu ino line copp er(Ⅱ)salt)原药由浙江大学农药与环境毒理研究所提供。所有药剂均用丙酮或者甲醇等溶剂配制成10m g/mL的母液备用。

1.3　防治番茄叶霉病菌药剂的室内筛选

1.3.1　菌丝生长速率法　各药剂根据预试验结果设置5～7个处理浓度。各菌株先在PDA平板上培养5d,然后在同一圆周上制取菌丝块(直径0.5cm)接种到含不同浓度供试药剂的平板中央,分别以不含药剂但含相同有机溶剂的平板为对照(C K),每处理重复3次,整个实验重复2次。嘧霉胺的测定采用L2A sn合成培养基(K

2

H PO4 1g,M gSO4?7H2O1g,KC l0.5g,FeSO4?7H2O 0.01g,L2A sn2g,葡萄糖20g,琼脂20g,去离子水1L)[5],其他均采用PDA培养基。于25℃黑暗培养4d后测量各处理的菌落直径(cm),取平均值计算抑制率(%),通过浓度对数值(X)和抑制率机率值(Y)之间的线性回归关系求出毒力回

归方程和EC

50

值。

403农　药　学　学　报V ol.

10

抑制率(%)=

C K 的菌落直径-处理的菌落直径

C K 的菌落直径-0.5

×100

1.3.2　孢子萌发抑制率法　各药剂根据预试验

结果设置5～7个处理浓度,分别以不含药剂但含

相同有机溶剂的处理为对照(C K ),每处理重复4次,整个实验重复2次。各菌株在PDA 平板上培养7d 后,用无菌水洗下分生孢子即得分生孢子悬浮液,并调节浓度至每mL 含1×105

个分生孢

子。每个2%W A (水琼脂)平板加入100mL 分生

孢子悬浮液,并用玻棒涂抹均匀,于25℃下黑暗中培养12h 后观察分生孢子的萌发情况。取萌发率的平均值计算抑制率(%),通过浓度对数值(X )和抑制率机率值(Y )之间的线性回归关系求出毒力回归方程和EC 50值。

分生孢子萌发抑制率(%)=

C K 的分生孢子萌发率-处理的分生孢子萌发率

C K 的分生孢子萌发率

×100

1.4　紫外线诱导番茄叶霉病菌获得抗异菌脲突变体

先通过预备实验确定紫外线照射的亚致死时

间:将每mL 含1×107

个分生孢子的C F 223菌株的分生孢子悬浮液涂布于PDA 平板上,每皿0.2mL ,25℃培养2h 至分生孢子萌动期后,置于已预热0.5h 的紫外灯(40W ,254nm )下分别照射0、10、20、30、50、60、90、120和180s,照射距离为20cm ,照射后迅速放入25℃黑暗条件下培养,24h 后观察比较孢子的萌发情况,最后选择导致孢子萌发抑制率为95%的照射时间为亚致死诱变时间。本实验条件下为30s 。C F 223菌株的M IC (最小抑制浓度)确定方法如下:将每mL 含

1×107

个分生孢子的C F 223菌株的分生孢子悬浮液分别涂布在含1、3、5、8、10、20m g /mL 异菌脲的PDA 平板上,25℃下培养3d 后不能形成菌落的最低浓度即为M I C 。本实验条件下为8m g /mL 。

诱导抗性突变体实验是将每mL 含1.0×107

个分生孢子的C F 223菌株的分生孢子悬浮液涂布在含20μg /mL 异菌脲(能完全抑制C F 223菌落的形成)的PDA 平板上,如上紫外照射30s 后迅速放入25℃黑暗条件下培养,3～5d 后观察,菌落能扩展的经随机挑选、单孢分离和抗性验证后即为抗异菌脲突变体。1.5　抗异菌脲突变体的抗性水平及其对药剂的敏感性测定

采用菌丝生长抑制率法测定突变体对异菌脲的敏感性,以确定抗性水平,用同样的方法测定其对腐霉利、乙烯菌核利的敏感性,分析异菌脲与腐霉利、乙烯菌核利之间的交互抗性关系;采用与

1.3节中同样的方法测定其对其他药剂的敏感性。

本实验中每处理重复3次(生长测定)或4次(萌

发测定),整个实验重复2次。1.6　抗异菌脲突变体的生物学性状研究1.6.1　菌丝生长、分生孢子产生及萌发能力　各突变体及其亲本菌株先在PDA 平板上培养5d 活化,然后在同一圆周上制取菌饼(直径0.5cm )接种到PDA 平板中央,每个菌株重复4次。25℃下黑暗中培养4d 后,测量各菌落直径(cm ),取平均值代表生长能力;培养7d 后,用无菌水洗下分生孢子,用血球计数板计数,取平均值代表产孢能力;获得的各菌株的分生孢子悬浮液浓度都调节

至每mL 含1.0×105

个分生孢子,测定各自的萌发能力,每个菌株重复4次。

1.6.2　致病力测定　采用离体叶片法。各突变体及其亲本菌株的分生孢子悬浮液浓度均调节至

每mL 含1×106

个分生孢子,每张番茄叶片中央接种50mL 分生孢子悬浮液,接种后于80%RH 、12h 光周期和25℃条件下培养。接种后7d 调查发病情况。每个菌株用20张叶片,用平均的病斑直径代表致病力。1.6.3　对渗透胁迫的敏感性测定　参考马忠华

等的方法[6]

。各突变体及其亲本菌株先在PDA 平板上培养5d 活化,然后在同一圆周上制取菌饼(直径0.5cm )分别转移到含0、20、40、60和80m g /mL 氯化钠的PDA 平板中央,每个菌株重复4次。25℃下黑暗中培养4d 后,测量各菌落直径(cm ),取平均值计算对菌丝生长的抑制率(%),以此表示对渗透胁迫的敏感性。

菌丝生长的抑制率(%)=无氯化钠处理的菌落直径-氯化钠处理的菌落直径

无氯化钠处理的菌落直径-0.5

×100

5

03N o .3张传清等:

番茄叶霉病菌异菌脲抗药性突变体的诱导与生物学性状

2　结果与分析

2.1　番茄叶霉病菌群体对不同类型药剂的敏感性

本实验中药剂处理浓度与抑制率间表现出很好的相关性。番茄叶霉病菌对各供试药剂的敏感性与其对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的敏感性无关。根据对CF223(B en S2D ie R)、CF218(B en R2D ie S)和CF212(B en R2D ie R)3种类型菌株EC50的平均值, 16种杀菌剂抑制番茄叶霉病菌菌丝生长的活性强弱依次为腐霉利>乙烯菌核利>异菌脲>戊唑醇>百菌清>嘧霉胺>醚菌酯>代森锰锌>82羟基喹啉铜>丙环唑>苯醚甲环唑>嘧菌酯>灭锈胺>烯酰吗啉>烟酰胺>三唑酮;抑制孢子萌发的活性依次为醚菌酯>腐霉利>百菌清>乙烯菌核利>灭锈胺>82羟基喹啉铜>异菌脲>代森锰锌>嘧菌酯>烟酰胺>嘧霉胺>戊唑醇>丙环唑>苯醚甲环唑>三唑酮>烯酰吗啉。这说明二甲酰亚胺类杀菌剂对番茄叶霉病菌菌丝生长的活性最强,对孢子萌发也表现出一定的活性(表1)。