浅斟朱颜睡2013年秋季学期细胞工程实验报告
1.3.5.4.2 甲醇萃取 β-胡萝卜素
（若细胞净重大于1.2g，则加入15ml甲醇；若小于1.2g，则加入10ml甲醇） 1.3.5.4.3 乙醚纯化
（若细胞净重大于1.2g，则加入150ml乙醚；若小于1.2g，则加入100ml乙醚） 1.3.5.4.4 含量的测定
在波长452nm下测定吸光值A452。
2 实验结论
2.1 植物愈伤组织的诱导 本实验一共做了两次
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（1）第一次做时，共接种9瓶，共2瓶水侵化，2瓶霉菌污染，1瓶细菌污染，1瓶褐变，两瓶中的两块未受污染，一块既不生长，也不死亡，也无愈伤组织的形成，另一块长出很少的愈伤组织，其余块都被细菌污染。 成活率=2/8=25% 污染率=3/8=37.5%
1）水侵化的现象为：玻璃化现象是指在培养过程中材料呈半透明状,组织结构发育畸形（图1）；
2）霉菌污染的现象为：在组织块表面长满了各种颜色的菌丝，且组织块已经不能正常生长（图2）；
3）细菌污染的现象为：培养材料附近出现粘液状和发酵泡沫状物体,或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹（图3）；
4）褐变的现象为：外植体组织出现变黑，变棕褐色的现象（图4）； 5）长出愈伤组织的现象为：在外植体周围长出白色或淡黄色晶体（图5）。 （2）第二次做时，共接种6瓶，1瓶被霉菌污染，2瓶水侵化，1瓶细菌污染，2瓶无污染（污染的情况和愈伤组织情况见上五个图） 存活率=2/6=33.3% 污染率=2/6=33.33%
2.2 植物愈伤组织的再分化诱导
第一周观察接种的两瓶未出现污染，长势良好。
预期结果：在三周四周甚至再过一个多月，未污染的培养基应该在组织的表面长出小苗，在经过一段时间的培养，应该会长出植株然后可移植到自然环境中进行栽培。
2.3 植物细胞的悬浮培养以及胡萝卜素的分离提取和含量测定 （1）继代培养
本小组两人共接种五瓶，四瓶被细菌污染，一瓶长出疏松型愈伤组织
以下各图为被污染的情况（与愈伤组织污染现象基本相似）和完好的情况（疏松型愈伤组织可与愈伤组织诱导形成的致密型愈伤组织形成对比）
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（2）悬浮培养
本组八人培养的悬浮细胞未被污染，且长势良好，培养基清亮不混浊，但培养基和细胞的总重量相对于之前有所减少。 1 2 称量前(g) 168.3 172.3 称量后(g) 168.9 173 细胞净重(g) 0.6 0.7 悬浮培养后(g) 167.6 171.7 以下为悬浮培养的细胞（图7）
图1 外植体水侵化情况 图3 外植体被细菌污染情况 图2 外植体被霉菌污染情况
图4 外植体褐化情况
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图5 长出的愈伤组织情况 图6 疏松型愈伤组织（继代培养情况）
图7 悬浮培养的细胞 图8 组织块切割示意图
（3）胡萝卜素的分离提取和含量测定
1）以悬浮细胞为材料测得的吸光度值含量的测定为：0.312、0.306、0.304、0.299、0、293，平均值为：0.303（细胞重量为1.5g）
己烷体积为3.1ml（甲醇加入体积：20ml，乙醚加入体积为150ml） β-胡萝卜素含量=0.303/0.25/3.1ml=0.390μg/ml
2）以新鲜胡萝卜为材料测得的吸光度值含量的测定为：0.937、0.920、0.906，平均值为：0.921 己烷体积为 3.8ml
β-胡萝卜素含量=0.3921/0.25/3.8ml=0.969μg/ml
3 实验分析与讨论
3.1 植物愈伤组织的诱导
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3.1.1 在培养过程中污染是经常发生的,造成污染的原因很多,如工作环境及仪器的因素、培养基及器皿灭菌不彻底、外植体带菌、操作时不遵守操作规程等,但造成污染的病原主要分为细菌和真菌两大类；
3.1.2 真菌性污染主要指霉菌引起的污染。真菌性污染,一般多由接种室内的空气不清洁,超净工作台的过滤装置失效,操作不慎等原因引起. 此类污染可通过完善操作、培养环境、严格操作程序来克服；
3.1.3 出现细菌性污染，可能是因为外植体带菌或培养基灭菌不彻底,但主要是操作人员的不慎造成；
3.1.4 除要求操作人员严格按照无菌操作顺序操作外,对外植体带菌引起的污染,情况则比较复杂,与外植体的种类、取材季节、部位、预处理方法及消毒方法等密切相关；
3.1.5 要取得理想的无菌材料,以春夏生长旺季、当年生的嫩梢为佳,且取材应尽量选择晴天中午进行,或取离体枝梢在洁净空气条件下抽芽,然后从新生组织中取材接种；
3.1.6 外植体的彻底消毒是控制污染的前提,应根据不同材料选择合适的消毒剂和消毒方法,有些特殊材料还需进行预处理,为达到最佳消毒效果,对于材料内部带菌的组织,有时还需在培养基中加入适量抗生素，把污染完全控制在可接受的范围；
3.1.7 外植体会变黑色或褐色有可能是因为在接种时没等镊子等工具变凉直接切割外植体，导致外植体被烧黑，也可能是因为组织中的酚类化合物被氧化产生棕褐色的醌类物质,进而使整个外植体组织受到伤害而变褐色；
3.1.8 而产生的酚类物质导致的褐变又受多重因素的影响，首先要选择适宜的外植体,所选材料的年龄、取材部位、材料的大小及外植体受伤害程度等均能对褐变产生影响，褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系；
3.1.9 外植体受伤害程度直接影响褐变,切割时应尽可能减小伤口面积,并缩短切口暴露在空气中的时间；酒精消毒虽然效果较好,但易对材料造成伤害,导致褐化,升汞对外植体伤害比较轻. 且消毒时间越长,消毒效果越好,但褐变越严重. 因而,选择合适的消毒剂和消毒方法至关重要；
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