浅斟朱颜睡2013年秋季学期细胞工程实验报告
植物细胞工程实验报告（1-3）
植物愈伤组织的诱导、再分化及细胞的悬浮培养
柳蕾
（云南大学生命科学学院，生命科学与技术基地班，20111070021）
摘要：原理和目的：根据植物细胞的全能性理论，通过脱分化、再分化等过程，通过胡萝卜愈伤组织的诱导学会通过培养基成分调控无菌操作诱导植物愈伤组织的基本技术方法，通过实验进一步深入领会植物细胞分化、脱分化、再分化的概念和过程，学习外植体的清洗、消毒、剪切和接种，无菌操作间、实验台等的消毒以及无菌操作技术等；根据胡萝卜愈伤组织经过多次继代，在细胞分裂，细胞形态和分化方面会产生各种变化，合理调节培养基中激素的种类和浓度配比，可以诱导疏松性愈伤组织的产生。利用愈伤组织获得单细胞或者小细胞团块，可以建议细胞悬浮（大量）培养的初代培养体系，并在此基础之上进行培养物的继代和保持，进行有用次生代谢物的生产的原理，学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法和相关操作，通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培养技术生产有用次生代谢物这一个技术的主要流程，技术体系和注意事项，学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和方法。
关键词：愈伤组织的诱导；再分化；继代培养；悬浮培养；胡萝卜素的提取
0 引言
植物组织培养技术是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体,在人工配制的环境里培养成完整的植株。 植物组织培养的依据是植物细胞“ 全能性”及植物的“再生作用”。 1902年,德国著名植物学家G.
Haberlanclt 根据细胞学理论,大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直到单个细胞,进行悬浮培养，再提取代谢物的过程，即植物体细胞在适当的条件下,具有不断分裂和繁殖,发育成完整植株的潜力的观点。 1943年,美国人
White在烟草愈伤组织培养中,偶然发现形成一个芽,证实了G. Haberlanclt 的
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论点.。自G. Haberlandt 提出的细胞全能性理论以来,在许多科学家的努力下,植物组织培养技术得到了迅速发展,其理论和方法逐渐趋于完善和成熟,并广泛应用于农业、林业、园艺、医药等行业,产生了巨大的经济效益和社会效益。
1 材料与方法
1.1 植物愈伤组织的诱导 1.1.1 实验仪器与用品
无菌培养皿、无菌吸水纸（用饭盒包装灭菌）、镊子、解剖刀、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、灭菌器 1.1.2 实验培养基配方
MS+2,4-D （1mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂 1.1.3 实验试剂
0.1%的HgCl2液，10%的次氯酸钠液，75%酒精，无菌水 1.1.4 实验材料
胡萝卜根，至少长20cm，直径3cm 1.1.5 实验方法
1.1.5.1 培养基的配制：
MS+2,4-D （1mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂）
大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素
1.1.5.1.1 从母液中取出（移液管）所需的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分，注意计算清楚各种物质在所须配制总体积下的加入量，将其放入小烧杯中；
1.1.5.1.2 在洁净的搪瓷缸里加入一定量的水（3/4）及所需要的琼脂，加热并不时搅拌，注意防止琼脂沉底焦糊；
1.1.5.1.3 待琼脂溶解（呈透明状，即无固体条状或丝状物，均匀而透亮）后，加入（1）中所取的各种母液及糖，并不断搅动使其混合均匀；
1.1.5.1.4 用1N HCl or NaOH 调整PH值到所须值（一般为5.8）； 1.1.5.1.5 加水至所须刻度；
1.1.5.1.6 趁热将培养基分装到培养用的容器（三角瓶等）中，注意不要把
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培养基黏附到瓶口或瓶口附近的内壁上，以免今后引起污染；
1.1.5.1.7 将分装好培养基的容器盖上盖子； 1.1.5.1.8 高压灭菌后取出，放于室温中冷却备用； 1.1.5.1.9 培养基及无菌用品的灭菌，121℃，30min。
1.1.5.2 外植体材料消毒：取6—8cm长的胡萝卜一段进行以下操作：
1.1.5.2.1 清洗：（流水冲洗）以下各步在超净台上进行；
1.1.5.2.2 将材料转入无菌烧杯或罐头瓶，加入75%酒精浸泡1—2min； 1.1.5.2.3 倒去酒精用0.1%升汞或10%的次氯酸钠液浸泡10—15min，不断搅拌；
1.1.5.2.4 倒去消毒液用无菌水洗涤3—5次；
1.1.5.2.5 转至吸水纸上，吸取多余水分（同一吸水纸部位不要重复使用）； 1.1.5.2.6 用解剖刀切去两端各0.5~1cm部分，将中断切成0.7cm厚的薄圆片；
1.1.5.2.7 将圆片移至无菌的部分，用刀切去外皮和中柱部分，将形成层切成1cm2的小片(图8)。 1.1.5.3 接种：
左手拿装有培养基的罐头瓶，接近酒精灯，用右手揭去盖，将瓶外部在灯焰上燎数秒钟，并旋转使充分灼烧灭菌，右手用镊子夹取材料小片送入瓶内，平放于培养基表面，轻按一下，使其紧密接触培养基。每瓶3块，均匀分布，封好瓶口。
1.1.5.4 培养：
放入25℃温箱中暗下培养一个月。
1.2 植物愈伤组织的再分化诱导 1.2.1 实验仪器与用品
无菌培养皿、无菌吸水纸（用饭盒包装灭菌）、镊子、解剖刀、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、灭菌器 1.2.2 实验培养基配方
MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.2mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂
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1.2.3 实验材料
愈伤组织诱导的培养材料 1.2.4 实验方法
1.2.4.1 培养基的配制：
MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.2mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂）
大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素（配制方法与愈伤组织的诱导相同，只是有些激素或物质的量不同） 1.2.4.2 接种
建立起来的无菌培养物
无菌条件下切割分开
接种在分化培养基上
适当条件下（25℃温箱中光照下）培养1-3周
培养反应的观察
1.3 植物细胞的悬浮培养以及胡萝卜素的分离提取和含量测定 1.3.1 实验仪器与用品
无菌培养皿、无菌吸水纸（用饭盒包装灭菌）、镊子、解剖刀、超净工作台、恒温培养箱、光照、三角锥形瓶、天平、纱布/滤纸、冷凝管、蒸馏瓶、分液漏斗、表面皿、分光光度计、比色皿、移液器、移液器 1.3.2 实验培养基配方
继代培养：MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖,0.9%琼脂 悬浮培养：MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖 1.3.3 实验试剂
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10% KOH的甲醇溶液、乙醚、己烷 1.3.4 实验材料
愈伤组织诱导的培养材料 1.3.5 实验方法
（悬浮培养体系的建立：外植体 愈伤诱导 愈伤继代 单细胞或细胞细胞团块的获得 液体培养） 1.3.5.1 培养基的配置
（1）植物愈伤组织的继代培养：MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂
（2）悬浮培养的培养基：MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖 1.3.5.2 植物愈伤组织的继代培养
将愈伤组织诱导的培养材料转移到新的培养基中，适当条件下培养，产生疏松性愈伤组织用于细胞的悬浮培养 1.3.5.3 植物细胞的悬浮培养
1.3.5.4 胡萝卜素的分离提取和含量测定 1.3.5.4.1 悬浮细胞的收集
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