Keywords:melanin.Silb,BAClibrary,TYRPi。fD
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独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名:I'W:垆。尹年C,q∥日
关于论文使用授权的说明
…烹人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留煮享篓吝竺复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复型三粤孽存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。‘‘。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
研究生签名导师签名
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2
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缩略词
AFLPAmplifiedfi'agmentlengthpolymorphism
ASPAgoutisignalpeptide
BSex—linkedbarring,dilution
BACBacterialArtificialChromosomes
bHLHbasic-helix-loop—helix
CHEFClampedbormogeneousfieldelectrophoresis
CRlChickenrepeat1elements
DoP—PCRDegeneratedoligonucleotideprimed-PCRDSBDouhlestrandbreaks
ESTExpressedsequencetag
FPCFingerprintingcontig
GGAGallusgalluschromosome
IDDelTflalmelanininhibitor
LAMPlLysinassociatedmembraneproteinI
MACsMaero-chromosomes
MICsMicro-chromosomes
MSHMelanoeytestimulatehormone
PFGEPulsedfieldgelelectrophoresis
QTLQuantitativetraitIocHs
RAPDRandomamplifiedpolymorphismDNA
RFLPRestrictionfragmentlengthpolymorphism
RHMapRadiationhybridmap
RNAiinterferingribonucleicacid
siRNAShortinterferingRNA
SNPSinglenucleotidepolymorphism
SSCpSingle—strandedconformational
polymorphismSTSSequencetaggedsites
TYRtvrosinase
TYRPlTyrosinase-related-protein1
TYRP2Tyrosinase-related-protein2
USFupstreamstimulatoryfactor
UTRUntranslated
region
VNTRVariousnumberoftandem
repeat
WG-RHWhole
genomeradiationhybridsyRecessivewhiteskin
YACYeastartificiaIchFomosomes
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文献综述
引言
人类基因组计划在美国正式启动以来己获得了巨大进展,2000年底人类基冈组的序列草图绘制成功。随后的儿年,全世界的分子生物学家和遗传学家都从人类的基闭组图谱中获得了人量宝贵的信息席崩于白己的研究,促进了整个生命科学领域的发展。随后,果蝇、小鼠、斑马鱼等模式动物的基冈组计划也迅速的开展起来并敬得了丰寓的成果。
基冈组物理图谱不仅是基冈组测序的产物和基冈图位克隆的桥梁,而且对研究基冈的结构、功能、时空表达调控以及基因间的关系研究都是极其重要的。模式生物的全基冈组物理图谱一旦得以构建,即可通过基因组序列分析找到大量的功能基冈,还能发展新的分子标记以增强遗传图谱上分子标记的密度,加速基因图位克隆的进程。
鸡是脊椎动物中唯一的鸟类模式生物,在发育生物学、免疫学等基础生物学研究中发挥着重要的作用。最甲.在鸡中发现了B淋巴细胞以及病毒的肿瘤特性,抗体的基因组合选择形成机制,脊椎动物形态发生过程的分子机制。以及免疫系统(MHC)的分子和基因组进化机制等(BrownW.R.A.eta1.。2003)。鸡作为模式生物的优势在于:①拥有众多的近交系可供选择,每一近交系都有经过选择的独特的疾病和生产性状;②亲本群体可以产生大最的Ji彳裔家系,并进行个体性状评定,从而减少遗传试验的负担:③商业_}=}j鸡只都有准确的系谱记录,成本低廉:
④红细胞有核,有助于大规模、高品质的DNA提取:⑤鸡的基因组较小,约是哺乳动物的一’h较易了__克隆所要研究的基因;⑥鸡胚胎发育过程大都在体外进行,易丁操作,是发育生物学研究的极好实验材料。而且,研究发现鸡同人之间基冈组序列的同源性或同线性(synteny)
程度要高于其与鼠之间的同源性,能利用人类基因组计划的数据和结果进行比较基冈组学研究,阐明鸡的基冈组功能。
继人、小鼠和果蝇等模式动物的测序计划之后,鸡的基因组测序计划被提到日程上来。为了鸡的基因组测序丁作.世界上的几个课题组构建了鸡的基因组细菌人■染色体(BAC)文库,用以测序的BAC重叠群构建丁作和测序:1:作于2003年底已基本完成,部分序列己T'2004年3月释放。但是所有的文霹都不可能覆盖全部的基因组,而且测序工作中必然会存在困难和错误.所以目前得到的序列数据中还有大量的缺口需要填补。在很长的时间内鸡的基因组图谱还需要利用其它的基因组文库对其进行补充和完善。
本文构建的具有高基因组覆盖率的丝羽乌骨鸡的基冈组BAc文阵,对于鸡fl匀基冈组测序r作是非常有价值的资源,可以用以补充和完善现有的基冈组幽谱。
另一方面,人类的许多疾病都与黑色素有芙,如黑色素瘤、着色性干皮痈、帕金森氏症、亨廷氏舞蹈症等。本文朋以构建基田组文库的中国的地方鸡种丝羽鸟骨鸡,与其它鸡种相比体内含有人蟹的黑色素,是研究黑色素沉积和分布机制的理想研究对象。基于二鸡的模式动物的地位,研究黑色素基因在鸡中的表达和调控及对表型的影响必然会对人类与黑色素沉积相关的疾病的研究提供重要的参考信息。
为了研究黑色素沉积和分布的机理,本文利用丝羽鸟骨鸡的基闳纽BAc文库,应用比较基因
中国农业大学博士学位论文第一章立献综述组学和鸡的遗传图谱、物理图谱的研究结果和研究方法,对位于z染色体上影响丝羽鸟骨鸡的黑色素沉积的候选的基因(TYRPZ)进行了基因结构的分析和它的表达与黑色素沉积的芙系的研究。对用传统遗传学方法定位的影响胫色的表皮黑色素抑制基因(dermalmelanininhibitorgene,ID)所在区段进行了BAC重叠群构建的丁作,期待在不久的将来可以克隆这个基冈。
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1鸡的基因组研究
基闭组学(genomics)是遗传学研究进入分子水平后发展起米的一个分支,主要研究生物体内全基因组的(genome)的分子特征。一个物种的单倍体的染色体数目称为该物种的基因组或染色体组,它包含了该物种自身的所有基因(朱军,2001)。
基因组学的重要组成部分是基因组计划(genomeproject),人体可分为A.构建基因组的遗传图谱(geneticmap);B.构建基因组的物理图谱(physicalmap);C.测定基冈组的全部序列;D.构建基因组的转录本图谱:E分析基因组的功能。
基冈组计划的开始始于1990年人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)的启动。1996年构建了标记密度为0.6Mb的人类基因组遗传图谱。2000年完成了人类基冈组草图的构建,并测定了基因纽的大最核苷酸序列。人大促进了生物信息学等学科和新的实验技术、研究系统和实验设备的发展。
由丁以人类为对象的研究实际上受到诸多的限制,人类的基困组计划还需对其他模式生物如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪等进行相应的研究,为研究人类基因绸的战略提供重要的依据。伴随人类基闻组计划的提前完成帮l美国国家人类基因组研究院(NHGRI)今后工作目标的公布(CollinsF.S.等,2003),基因组时代已经到来。目前已有多种模式生物的基因组序列已全部测定。
鸡的基因组测序计划在美国华盛顿火学基因组中一O(WUGSC)、英国Sanger研究所及中国北方基因组研究所暨华大基因研究中心的合作F展开。于2003年12月,原始序列的测定已经完成,覆盖基冈组6倍以上的序列正在拼接和定位分析之中,全部I:作应在2004年底完成(PearsonH等,2003)。
1.1鸡的基因组图谱
家鸡(Gallusgallusdomesticus)起源于东南弧,其祖先被认为是红色原鸡(rediunglefowl),丁公元前l,4000年最先出现于中国。
鸡的基因组由39对染色体组成,约1.2×109碱基对,包括8对火染色体(macro。chromosomes.MACs),1对性染色体(z利W),其它30对被认为是微小染色体(micro.chromosomes.MICs)。鸡的l到6号染色体大小相似,最大的有8rtm。鸟类的性染色体表现出异配型特点.雌性个体是异配型(zw),雄性则是同配型(zz),这与哺乳动物有所不同。鸡染色体大多是常染色体。HjC带技术对异染色质进行染色(SumnerAT.等,1972),只有z染色体末端火部分是C带特性,w染色体则儿乎全是异染色质,小染色体人都具有小的c带。
鸡基因组同其他动物一样有重复序列。在许多动物基因组中,如两栖动物爪蟾(Xe”opus)中.住2kb的简单拷贝序列间散布有短的重复序列0.3kb。鸟类基因约的组成有类似果蝇基因组的长散布模式特点。目前所知,鸡基因组重复序列中唯~典型的是鸡重复成分1(chickenreDeat1elements,CRI),是由Stumph等(StumphW.E.等,1981)发现的中度重复序列。该成分是古3
老的重复序列,在鸡中有六个砸族,其中四个有共同祖先(v柚de喀onT.L.等,1994)。超过95%的CRl成分被鉴定出来,它的平均长度300bp,最大的有2.3kb(BurchJB、E.等,1993)。该成分具有截断的5,末端和一致的3’端,包含有两个或两个以上的八个核苷的重复。CRI成分是非长末端重复逆转座子(ChenZ等,1991),有类pol的开放阅读框.负责编码逆转录酶,使该成分在整个基因组中转移。据估计,整个鸡基因组中大约有100,000拷贝。
在进行人规模序列测定之前,构建基因组图谱是测定大基因组全部序列的重要一环。在变成基冈组全序列图之前.鸡基因组图谱是一种整合例谱,它将遗传图谱和物理图谱中的放射杂交图谱(RHmap)、细胞遗传学图谱、转录图谱和基因图谱的共有信息进行综台.形成一致图谱(SchmidM等,2000)。
1.1.1鸡的遗传图谱
遗传图谱的构建是根据任一遗传性状(如己知的多型性基因位点、功能未知的DNA标记、可鉴别的表型性状)的分离比例,将其定位在基因组中。因此遗传图谱是根据等位基因在减数分裂中的重组频率,来确定其在基冈组中的顺序和相对距离的。
11.1.1图谱标记
图谱构建中需要可以鉴别的标记(marker)。构建遗传图谱中,可用基冈和DNA标记。
(1)基冈标记。基因控制表型,所以就是利用可以鉴别的形态、生化等表刑性状做标记。遗传学中最早的果蝇连锁图就是利用控制果蝇眼睛的一些基冈作为标记,分析备基冈间的连锁关系及遗传距离,绘制出连锁图谱。

