考马斯亮蓝法测定(实验报告)

考马斯亮蓝法测定(实验报告)

考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量

吴凡郭梦雨

摘要: 本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH fi、外源添加物对果

肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果表明：外源添加PV嗣EDT/以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl 提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP)，此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%。

关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl 缓冲液、外援添加物

1 实验部分

1.1 实验原理

果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content) 是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nmi 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度高，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0?1 000 卩

g/mL，最小可测2.5卩g/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。

1.2 实验准备

1.2.1 实验材料

新鲜苹果、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、85%磷酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、HCI、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯比咯烷酮（PVP）、NaCI、MgCl2、抗坏血酸、半胱氨酸、B -巯基乙醇。

考马斯亮蓝法测定(实验报告)

1.2.2仪器与设备

容量瓶（25mL 10个、100mL 1个、500mL 1个、棕色瓶1个、分析天平、胶

头滴管、烧杯（50mL 2个）、移液管（20mL）、量筒（10mL 1个、25mL 1个）、研钵、移液枪（1000丄）

UV-1800型紫外-可见光分光光度计日本岛津公司；旋涡混合器；PH计。

1.2.3试剂配制

1.2.3.1标准蛋白质溶液（100卩g/m牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25mg,力卩水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40mL用蒸馏水稀释至100mL

1.2.3.2考马斯亮蓝试剂：称取50mg考马斯亮蓝G-250,溶于25mL 90%乙醇中，加入50mL 85g/100mL的磷酸，再用蒸馏水定容到500mL，摇匀，贮于棕色瓶中；

1.2.3.3 提取液：pH 7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCI 缓冲液（100mmoI/L）;

1.2.3.4 梯度浓度Tris-HCI 缓冲液（pH 9.0）: 10、30、50、80、100mmoI/L;

1.2.3.5外源添加添加量：乙二胺四乙酸（EDTA）（1mmol/L）、聚乙烯比咯烷酮（PVP）（1g/100mL）、NaCI（0.15moI/L）、MgCI2（0.5mmoI/L）、抗坏血酸（2mmol/L）、半胱氨酸（2mmoI/L）、&巯基乙醇（2%，V/V）。

1.3实验步骤

1.3.1考马斯亮蓝G-250溶液及其蛋白反应液全波长扫描

取3mL配制好的考马斯亮蓝G-250溶液或其与蛋白反应液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度计在400?800nm范围内进行扫描，确定考马斯亮蓝G-250容液和其蛋白反应液的最大吸收峰和空白吸收值。

1.3.2标准曲线的绘制

取6支试管，按表1加入标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀后，向各管中加入5mL 考马斯亮蓝G-250溶液。每加完一支试管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太

剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。混合后静置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm波长处测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得线性回归方程

表1绘制标准曲线的各试剂添加量

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133果蔬组织可溶性蛋白质的提取133.1最佳缓冲溶液和pH值的确定

称取苹果果肉样品1g,加入5mL水或梯度pH值Tris-HCI缓冲液，冰浴上充分研磨匀浆，移入10mL离心管中，于4000rpm离心15min,收集上清液即为可溶性蛋白质提取液，低温保存备用。

1.3.3.2最佳提取缓冲液浓度的确定

以上节确定的提取缓冲盐和pH值为基准，分别配制该pH值下浓度依次为0、

10、30、50、80、100mmol/L的提取缓冲液⑻。提取体系及方法同1.3.1节。1.3.3.3适宜外源添加物的确定

以上节确定的最佳缓冲溶液为基准，分别添加以下浓度的添加物：EDTA(1mmol/L)、

PVP(1g/100mL)、NaCI(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、半胱氨酸

(2mmol/L)和B -巯基乙醇(2%，V/V)。提取体系及方法同1.3.1节。(添加组合为：抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、&巯基乙醇、

NaCl、MgCl2、PVP+ 3■巯基乙醇、PVP + EDTA、EDTA + PVP+ 3■巯基乙醇) 1.3.3.4苹果组织可溶性蛋白质含量的测定

吸取1.0mL样品上清液，放入试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置5min后在波长595nm处比色，按照制作标准曲线同样的方法测定吸光度。重复3次。

1.3.3.5数据处理

Excel统计分析所有数据，计算标准误差并制图。

2结果及讨论

2.1标准曲线的绘制

表二不同吸光度值对应BSA含量

考马斯亮蓝法测定(实验报告)

标准曲线

查阅文献得，可溶性蛋白质质量浓度高时，考马斯亮蓝G-250染色法线性降低，R=0.9929。

可溶性蛋白质量浓度在80ug/mL以内时，该方法线性关系较好，相关系数R=0.9929。因此，考

虑到该方法高浓度时非严格的线性关系，实际应用时，相关系数R在0.99-1范围内属基本可以接

受范围。本实验R=0.9990，线性很好。