笑得太过实验八 酵母菌形态观察及死、活细胞的鉴别
一、目的要求
1、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。
2、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的原理和染色方法。 3、了解酵母菌的个体和菌落形态特征，及其与细菌的区别。 二、基本原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，少数能形成假菌丝，通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，故具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。 酵母菌的菌落较湿润，与细菌菌落较相似，但不透明，有特殊的酒香味。 三、实验器材
1、菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的平板培养物。（提供空气中细菌培养平板，用于酵母和细菌菌落形态的比较观察）。 2、染色剂：吕氏碱性美蓝染液，石炭酸复红。
3、仪器和其他用品：显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、滤纸片、接种环、镊子等。 四、实验步骤
1、酵母个体形态及死活细胞观察
在载玻片上滴加1小滴生理盐水，用接种环挑取少量菌苔，涂布均匀 - 在载玻片中央滴加1小滴吕氏碱性美蓝染色液（0.1%）混合均匀 - 盖上盖玻片 - 放置3分钟 - 先低倍后高倍镜下观察酵母形态和出芽情况 - 30分钟后再观察。并根据颜色来区别死活细胞，蓝色细胞是死细胞，无色细胞是活细胞。 2、菌落形态观察
仔细观察酵母菌菌落，记录菌落大小、形状、透明程度、颜色、表面干燥或湿润，能否易挑取等特征，注意与细菌菌落的区别。 五、实验过程中的注意事项
1、酵母菌制片时，当菌体与染液混合时注意不要剧烈涂沫，以免破坏细胞。
2、生理盐水和染液滴加量均要适中，盖盖玻片时，染液过多易溢出，过少易产生气泡。盖玻片缓慢倾斜覆盖，能避免产生气泡。
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3、观察菌落特点时，注意其表面是否湿润、大小和形态，注意与细菌菌落的区别。 六、实验结果
1、绘图说明显微镜下所观察到的酵母菌的形态特征。
2、根据你所观察到的吕氏美蓝染液作用时间与酿酒酵母死、活细胞数量变化的情况，填写表4-1。
表4-1 酵母染色结果记录表
吕氏美蓝浓度 作用时间 每视野活细胞数（个） 每视野活细胞数（个）
七、思考题
在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？ 八、讲授重点
1、酵母死活细胞鉴定原理。
2、酵母细胞的个体形态，注意出芽繁殖方式是其主要特点。 3、怎样分辨酵母与细菌菌落。 九、实验要求
每位学生染色观察、拍照。提交2张在高倍镜下观察到的酵母染色形态图，标明菌种名称、总放大倍数、观察时间。 描述菌落特征。 十、考核点
1、无菌操作是否熟练规范 2、制片
3、显微镜操作是否熟练规范
3min 0.1% 30min
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实验九 霉菌的个体形态和菌落形态观察
一、目的要求
1、学习并掌握霉菌的制片技术。
2、了解常见霉菌（青霉、曲霉、根霉等）形态特征和相互区别。 3、了解霉菌菌落形态特征及其与放线菌、酵母菌和细菌菌落的相互区别。 二、基本原理
霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分为基生菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段后分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。 霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及其孢子的形态特征是分类的重要依据。可用直接制片法和透明胶带法观察，也可采用载玻片培养观察法观察常用石炭酸美蓝染液对霉菌进行染色，盖上盖玻片后直接镜检。
根霉营养体是无隔多核菌丝体，营养菌丝产生匍匐菌丝，以跳跃方式蔓延生长，在匍匐丝交接处长出假根，上方长出孢囊梗，顶端膨大成孢子囊，有囊轴、孢囊孢子、囊托。有性生殖产生接合孢子，接合孢子外无附属丝。曲霉菌在营养菌丝的足细胞上长出无隔的分生孢子梗，顶端膨大形成顶囊，在顶囊的表面上长出单层或双层小梗，在小梗顶端分化出串珠状的分生孢子。青霉菌菌丝体有隔，从菌丝细胞长出分生孢子梗，有隔有分枝，小梗有单轮或双轮生，双轮生中又分为对称和不对称。分生孢子梗的分枝和轮生组成了复杂的扫帚状分枝结构。在扫状枝上，最后一级分枝为产生串生链状分生孢子的小梗，呈瓶梗状，着生小梗的细胞叫梗基，支持梗基的细胞叫副枝。分生孢子常为球形、椭圆形，呈蓝绿色。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗很多，是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，用低倍镜即可观察。
群体（菌落）形态：霉菌呈丝状生长。菌丝也分营养菌丝和气生菌丝。菌丝以菌丝体的形式行使其功能。霉菌的菌落呈明显的丝状体，但与放线菌菌落相比比较疏松，一般呈绒毛状、颗粒状、棉絮状等。 三、实验器材
1、菌种：毛霉（Mucor sp.）、青霉（Penicilliun sp.）、曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus sp.)的平板培养物。
2、染色剂：吕氏碱性美蓝染液或石炭酸复红染色液。
3、仪器和其他用品：显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、滤纸片纸、解剖针、镊子、生理盐水等。
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四、实验步骤
1、霉菌直接制片及菌体观察
取干静载玻片，中央滴加一滴染色液， 用解剖针从菌落边缘处挑取少量已产生孢子的霉菌菌丝放在染液中，用解剖针仔细将菌丝分散开，盖上盖玻片。低倍镜观察后转高倍镜观察。
2、透明胶带制片法
取干静载玻片，中央滴加一滴染色液， 用食指和拇指粘在一段透明胶带两端，使透明带呈U形，胶面朝下，使呈U形 ， 用透明胶带面轻轻触及霉菌菌落表面 ， 使粘在透明胶带上的菌体浸入载玻片上的染液中，并将胶带两端固定在载片两端。低倍镜观察后转高倍镜观察。
3、菌落形态观察：仔细观察霉菌的琼脂平板上的菌落，记录每种霉菌的菌落大小、形状、颜色、表面是否有小黑点名小颗粒，能否易挑取等特征。 五、注意事项
1、制片时，取菌和分散菌丝要细心，要从菌落边缘取，不要只取大菌落中央的菌丝，否则观察不到完整菌丝体的结构。
2、不要搅动菌丝体，尽量减少菌丝断裂及形态的被破坏，盖盖玻片时避免了产生气泡。 3、若视野中只见孢子，不见霉菌的其它部分时，可对挑取的霉菌菌丝体，用50%的酒精浸一下，以除去脱落的孢子，再制片、染色和观察。。 4、观察菌落特征时，要选择分离得很开的单个较大菌落； 5、勿随意移动开盖，以免孢子飞散污染实验室。 六、实验结果
1、拍摄并说明所观察到的四种霉菌的形态特征。
2、根据你对琼脂平板上的放线菌、酵母菌和四种霉菌的的菌落观察，将结果记录在表4-2。
表4-2平板菌落观察结果记录表
菌种 放线菌 酵母菌 毛霉 根霉 菌落大小 菌落颜色 表面干燥或湿润 形态 高度 边缘 能否易挑取 24
曲霉 青霉 七、思考题
1、在进行微生物制片时是否都需要进行涂片？为什么？ 2、黑曲霉和黑根霉在形态特征上有何区别？ 八、讲授重点
1、四类常见霉菌各自的典型特征 2、直接制片观察法与透明胶带法 九、实验要求
每位学生制作4个标本片，观察、拍照。提交4张在高倍镜下观察到的霉菌形态图，标明菌种名称、总放大倍数。 描述菌落特征。 十、考核点 1、制片技术
2、显微镜操作是否规范熟练
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