笑得太过演示与录相
1、观察前准备：镜座距实验台边缘约10cm，光源调节，调节目镜、调节聚光器数值孔径值。 2、显微镜观察： （1）低倍镜观察 （2）高倍镜观察 （3）油镜观察
一种方法是先低倍再高倍再油镜，使用微调节器聚焦。第二种方法是在低倍下找到样品区，用粗调节器升高镜筒，将油镜转到工作位置，在样品区滴加镜油后，从侧面注视用粗调节器小心降下镜筒，并使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，调节聚光器的数值孔径及视野照明亮度后，用粗调节器将镜筒徐徐上升，再用细调节器使聚焦清晰为止。后一种方法尽量不用，在实验中重点介绍和使用第一种方法。
3、 显微镜用毕后的处理：上升镜筒，取下载玻片；擦净镜油；清洁物镜及目镜；还原各部
件，降下聚光镜。
（二）Motic显微数码系统的使用 演示与录相
建文件夹： 例如 D:\\2008-2009学年\\环境0511班姓名 图片要求： 1）格式：JPG
2）文件名：例如 环境0511班 姓名 大肠杆菌1000倍
五、注意事项
1、显微镜是精密仪器，在取放时要一手托住底座，一手握住镜臂，忌用单手拎提。 2、养成双目观察的习惯，忌单眼观察。
3、观察时可摘下近视镜或远视镜，因显微镜具有聚焦校正功能。若在观察时配载眼镜，应防止眼镜镜片与目镜镜片接触，以免造成镜片划痕。
4、显微镜照明亮度的调节，可通过升降聚光器或改变光源亮度进行调节，一般情况下聚光器都是调到最高位置。只要能获得良好的观察效果，也可以通过对虹彩光圈、聚光器高度、照明光源强度的协同调节灵活运用。
5、使用粗节器聚焦物像时，必须养成的习惯是：先从侧面注视并小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本。否则可能因误操作而损坏镜头及玻片。
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6、一般情况下，可利用同焦现象，对在低倍镜下看到的物像，可以转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置，然后用细调节器对物像进行清晰聚焦，可以避免因使用粗调节器时可能发生的误操作而损害镜头或玻片。
7、使用乙醇乙醚混和物或二甲苯等清洁剂时，不要过量使用或让其在镜头上停留时间过长，因清洁剂对镜头会造成损害。不能用手或滤纸擦镜头，以免污染镜头或产生划痕。 8．注意区分待观察样品与使用时间较长的显微镜镜头上的霉点等污物。 9．每人在D盘上建一个文件夹，文件夹名与文件名的要求。 六、实验结果
低倍、高倍、油镜下观察微生物形态图 七、思考题
1、用油镜观察时应注意哪些问题？
2、在载玻片和镜头之间滴加香柏油有什么作用？ 八、讲授重点 1、 显微镜结构 2、油镜工作原理
3、如何使用双目清晰观察物像 4、聚光器数值孔径的调节
5、利用物镜的同焦现象，如何配合使用低倍镜、高倍镜和油镜分别在不同物镜下获得清晰图像。
6、使用注意事项，特别是油镜。 7、数码显微镜系统软件的使用。 九、实验要求
1、练习使用显微镜，每位同学至少观察微生物的2个标本片（低倍、高倍物镜下观察霉菌，在低倍、高倍物镜、油镜下观察细菌），每一类型的微生物至少观察一个标本片。 2、用数码显微系统分别拍摄所观察到的微生物形态图，提交2张图片（高倍物镜下观察霉菌和油镜下观察细菌）。
3、制成图版打印黑白图片，并标注菌种名称、观察物镜及总放大倍数。 十、考核点
操作是否规范熟练以及油镜下的物像清晰度
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第三次实验（4学时，1人/组）
微生物标本的制备与染色
实验四 细菌的简单染色法
一、目的要求
1、学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。 2、学习无菌操作技术。
3、进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术。 4、初步认识细菌的形态特征。 二、基本原理
细菌制片常采用涂片法，通过涂沫能使细菌细胞个体均匀分散在载玻片上，有利于观察个体形态。加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，能杀死大多数细菌但不会破坏细胞形态。
微生物染色的基本原理是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透和吸附作用等。化学因素：主要是正负离子之间的相互吸引。染色剂按染料电离后所在地带电荷的性质分为几种类型：酸性染料（如酸性复红，刚果红，伊红和苯胺黑等）、碱性染料（碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰等，细菌易被这种染料染色）、中性（复合）染性（伊红，美兰，Gimsa染料）。
简单染色法是利用单一染料（如吕氏美蓝、碱性品红）对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性染料电离时的染色部分带正电荷，因此，碱性染料的染色部分容易与细菌结合使细菌着色。在显微镜下因与背景有明显对比而易于识别。 三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）斜面培养物。 2、 染色剂：碱性美蓝染液，石炭酸复红染液。
3、仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。 四、实验步骤
涂片- 干燥 - 固定 – 染色 – 水洗 – 干燥 - 镜检
1、涂片：取干净载玻片，用记号笔做好标记，滴一滴生理盐水于载玻片中央；用接种环无
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菌操作分别挑取适量菌苔，沾有菌苔的接种环在载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜（如果用液体培养物，则用接种环蘸取1-2环菌液直接涂沫于载玻片上）。
2、干燥：自然风干或用电吹风干燥。 3、固定：细菌涂面朝上，通过火焰2-3次。
4、染色：载玻片平放于桌面或载玻片支架上，滴加染液使之覆盖菌膜，一般染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染液，用自来水冲洗，水流宜缓，否则易冲掉细菌涂膜，至洗出的水无色为止。
6、干燥：用吸水纸吸去多余水分，自然风干。 7、镜检：制好的样片在显微镜下观察并记录。 五、注意事项
1、涂片时取菌量要适量，且要求涂布均匀。
2、无菌操作取菌时一定要等接种环冷却后再取菌，以免高温使菌体变形。
3、涂片需干燥后再加热固定，避免加热时间过长引起细胞易破裂或变形，以至载玻片破裂。加热固定时要用载玻片夹子或镊子，以免烫伤。 4、使用染料时注意避免沾到衣物和实验台面上。 六、实验结果
低倍、高倍、油镜下观察细菌形态图 七、思考题
在进行细菌涂片时应注意哪些环节？为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 八、讲授重点
1、 细菌简单染色的原理。 2、 无菌操作与细菌涂片操作要点。 3、 染色剂的类型与常用种类。 4、 显微镜的使用。 九、实验要求
每位学生至少用一种染色剂对一株菌进行染色、观察、拍照。提交1张在油镜下观察到的细菌形态图，标明菌种名称和总放大倍数。 十、考核点
涂片质量与油镜下图像的清晰度
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实验五 细菌革兰氏染色法
一、目的要求
1、 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 2、 掌握革兰氏染色法操作技术。 二、基本原理
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的，当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫－碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫－碘的复合物比较容易洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色是细菌分类的重要依据之一。 三、实验器材
1、菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）等细菌16-18h斜面培养物。
2、 染色剂：石炭酸复红染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇。
3、仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，镊子、接种环、载玻片夹子、滤纸等。 四、实验步骤
制片 - 初染 - 媒染 - 脱色- 复染 - 镜检
1、制片：与细菌简单染色法的涂片、干燥和固定过程相同。 2、初染：滴加结晶紫染色液于菌膜上1-2分钟，流水冲洗。
3、媒染：卢戈氏碘液冲洗一下菌膜，再滴加该液于菌膜上，静置1分钟。 4、脱色：95%酒精冲洗至无色后，再水洗。
5、复染：番红染色液覆盖菌膜，静置2分钟后水洗，干燥。 6、镜检：显微镜观察。
7、三区涂片染色：在熟悉上述革兰氏染色过程后，在同一载玻片上分别用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（或金黄色葡萄球菌）单独涂片及二者的混合涂片，染色、镜检比较观察。
五、实验注意事项
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