囧小猫实验二 预习报告
生物112 周泓兆 1102040226
一、研究背景：
酶作为生物体中最为重要的催化剂，其活性尤其受到关注，因为酶活性决定了酶的催化效率，也就是决定了酶的效果，这对于生化研究是非常有意义的。
二、研究目标：
在这次实验中，我们将对一些经典经典酶活力测定实验进行分析，对比其思路与设计差异，了解测定酶活力的基本方向和实验技巧。完成小麦萌发过程中淀粉酶活力的测定并分析测定结果是否合理。
三、研究策略：
小麦种子内，60%—70%的成分为淀粉。因此可以想到，在小麦萌发的过程中，需要有淀粉酶分解胚乳中的淀粉产生小分子糖类作为直接碳源和能源物质。萌发过程中，如果有不同淀粉酶的作用，我们可以通过控制反应条件来抑制其它酶的活性，从而测定其中一种酶的活性。我们测定酶活力的总体思路是：通过测定在一定时间（较短时间）后生成的产物量多少来量度这种酶的活性。
四、研究方案及可行性分析：
本实验中，我们定义酶活力单位为1g鲜重麦种1分钟所催化生成的麦芽糖毫克数为酶活力单位。而酶促反应是有很多抑制条件的，因此首先我们应当控制温度及pH，使得至少有一种酶处于最适温度及pH；其次我们需要控制反应时间，防止因产物浓度过高对淀粉酶产生抑制影响结果；第三我们底物浓度需要将酶过饱和，使得测定结果与底物浓度无关。设置对照，用以排除麦种中本来含有的麦芽糖和其它吸光杂质对结果的影响、操作过程中试剂对结果的影响。产物的测定方法使用可以测定微量物质的分光光度法，因此还需要麦芽糖溶液绘制标准曲线。
五、具体实验设计：
（1）麦芽糖的测定
1mg/ml麦芽糖标准液 dH2O 1 0 2 0.1 3 0.3 4 0.5 5 0.7 6 0.9 7 1.0 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 0 3,5二硝摇匀后分别加入1ml 3,5二硝基水杨酸，摇匀，在水浴中准确保温5min取出冷基水杨酸 却。 dH2O 用蒸馏水稀释至15ml，混匀，用分光光度计在520nm波度下比色，记录消光值，绘制标准曲线。 酶液 测定管1 测定管2 对照管1 对照管2 （2）α-淀粉酶活性的测定 各加入酶液1ml，在70℃恒温水浴中准确加热15min，取出后立即在冰浴中冷却。 pH 5.6柠檬酸缓冲液 0.4M NaOH 淀粉溶液 0.4M NaOH 冷却后各加入1ml pH 5.6柠檬酸缓冲液，置于40℃恒温水浴中准确保温15min。 0 各加入4ml 0.4M NaOH 向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即于40℃水浴中准确保温5min 分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀 0 取最终测定管与对照管中液体各1ml，分别加入1ml 3,5二硝基水杨酸试剂混匀，置沸水浴中准确加热5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，混匀，用分光光度计在520nm波度下进行比色，记录消光值。 （3）α-及β-淀粉酶总活性的测定 酶液 pH 5.6柠檬酸缓冲液 0.4M NaOH 淀粉溶液 0.4M NaOH 测定管1 测定管2 对照管1 对照管2 各加入稀释后的酶液1ml与1ml pH 5.6柠檬酸缓冲液，置于40℃恒温水浴中准确保温15min。 各加入1ml pH 5.6柠檬酸缓冲液，置于40℃恒温水浴中准确保温15min。 0 各加入4ml 0.4M NaOH 向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即于40℃水浴中准确保温5min 分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀 0 取最终测定管与对照管中液体各1ml，分别加入1ml 3,5二硝基水杨酸试剂混匀，置沸水浴中准确加热5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，混匀，用分光光度计在520nm波度下进行比色，记录消光值。 六、质疑及相关思考：
1、思考
（1）酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么？
答：我们需要用一段时间内（较短时间）每分钟每克鲜重麦种所催化底物分解所产生产物的量来代表酶活力。因此我们遇到的问题是：如何确定产物的变化量？实验中，我们用对照管代表原有的产物浓度，而测定管为最终的产物浓度，其差值为产物浓度的变化量。而且采用了分光光度法将原有的产物浓度和最终的产物浓度分别测出。
（2）根据上述总体思路你认为在设计酶活力测定实验时，对结果可信性影响最大的是哪方面？为什么？在该项设计中要注意什么？
答：首先，我认为这个实验中的两个测定管之间的同步性必须要保证。因为酶是高效的催化剂，操作的时间差可能会对实验造成非常大的影响。在实验中应当两人配合，以保证管1和管2反应时间基本一致。其次，酶在高温下易失活。因此我认为准确控制水浴温度与时间也是实验成败的关键。所以在实验中一定要把握好温度和水浴时间。
（3）淀粉酶和转氨酶的作用各自有何特点？在设计其酶活力测定的具体方案时你认为主要应该有哪些针对性的考虑？
答：淀粉酶只是催化分解作用，而转氨酶催化的是转氨基作用，反应物数量不同，也就是底物的添加方式不同。而且这两种酶最适条件也有区别。因此我认为设计测定时要考虑它们的最适条件和被抑制的条件，调整底物浓度等，使得实验尽可能满足单一变量原则。
2、质疑：
（1）研磨过程中，蛋白质被释放，其结构很容易被机械损伤，而且氧化的情况无法避免。因此酶活性受到的影响也是不可忽略不计的。因此每组的研磨时间、力度、石英砂的用量甚至局部产生的高温不同都会使得结果产生偏差，可重复性极低。
（2）麦种中也应该含有少量麦芽糖酶。测定管中的酶除了测定α-淀粉酶时进行高温处理外，其它在水浴分解淀粉过程中都未对其它酶做任何失活处理；而对照管中开始就将所有酶失活，包括麦芽糖酶，因此麦芽糖酶的含量也成为了本实验的变量。所以麦芽糖酶含量越高，所得结果比真实值越低。
