忽而白首雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤
后的运动功能障碍
摘要:哺乳动物雷帕霉素的受体(mTOR)是负向调节自噬的丝氨酸/苏氨酸激酶。雷帕霉是mTOR 信号抑制剂，可以促进自噬并在中枢神经系统 (CNS) 的几种疾病中起到神经保护作用。在本研究中，我们评估了小鼠脊髓损伤 (SCI) 后，应用雷帕霉素是否促进自噬，并降低神经组织损伤和减少运动功能障碍。我们的结果表明雷帕霉素的应用大大减少了损伤脊髓组织中p70S6K 蛋白质的磷酸化以及LC3和Beclin 1 的高表达。此外，损伤脊髓组织中，雷帕霉素组的神经元丢失和细胞死亡率明显低于溶剂对照组。并且，在大鼠后肢运动功能评分--（BMS评分）中，雷帕霉素处理组得分明显高于溶剂对照组。这些结果表明，脊髓损伤后，雷帕霉素通过抑制 mTOR 信号通路，提高自噬水平，并减少神经组织损伤和运动功能障碍。脊髓损伤后应用雷帕霉素治疗可能成为一种新的治疗策略。
关键词：自噬；Beclin1；LC3；雷帕霉素靶蛋白；雷帕霉素；脊髓损伤
前言：雷帕霉素是一种大环内酯类药物，最初被用作抗真菌剂。雷帕霉素是一种特殊的哺乳动物雷帕霉素受体阻滞剂(Ravikumar et al., 2004; Schmelzle and Hall, 2000)。它结合于胞质的FK结合蛋白(FKBP12)。雷帕霉素-FKBP12复合物抑制mTOR，阻止p70S6K 和4EBP1的磷酸化(Vignot et al., 2005)。因此，雷帕霉素抑制mTOR 从而促进自噬(Kamada et al., 2004;Klionsky and Emr, 2000;
Schmelzle and Hall, 2000; Wang and Klionsky, 2003)。
自噬是一种细胞内的分解代谢的机制，通过自噬溶酶体途径降解细胞质成分(Mizushima, 2004)。这种机制对维持稳态起着重要的作用，在某些疾病中起到保护作用(Hara et al., 2006; Liang et al., 1999; Ru-binsztein et al., 2005; Shintani and Klionsky, 2004)。自噬在细胞生长和应激状态下清除或者再利用长寿蛋白和受损的细胞器(Levine and Klionsky, 2004;Shintani and Klionsky, 2004)。已有研究表明，自噬对正常细胞的生长，分化和存活也很重要(Reggiori and Klionsky, 2002; Schmelzle and Hall, 2000)。
新近研究表明，应用雷帕霉素能够增强自噬，在亨廷顿病和帕金森病等某些神经退行性疾病中能够保护神经细胞(Malagelada et al., 2010; Ravikumar et al.,2004)。在这些退行性疾病中，应用雷帕霉素诱导自噬能够增强对聚集蛋白的清除从而减少其毒性(Berger et al., 2006; Webb et al., 2003)。以往的研究表明，在创伤性脑损伤和脑缺血后的神经组织中自噬活动是增强的(Bigford et al., 2009; Diskin et al., 2005; Ramiet al., 2008)。应用雷帕霉素增强自噬的活性并降低脑外伤和新生儿缺氧缺血性脑损伤的神经组织损伤(Carloni et al., 2008; Erlich et al., 2007a)。一些研究也表明，自体吞噬增强可以减少受中枢神经系统（CNS）中受损神经细胞的凋亡(Carloni et al., 2008; Pan et al.,
2008)。因此，使用雷帕霉素促进自噬被认为能够在中枢神经系统中起到神经保护功能。
我们此前曾报道，脊髓损伤（SCI）后受损的神经组织中自噬活性显著增强(Kanno et al., 2009b, 2011)。然而，在SCI后受损神经组织中细胞自噬的实际功能目前还不清楚(Kanno et al., 2009c)。此外，雷帕霉素治疗是否能促进细胞自噬和诱导脊髓损伤后受损的神经组织的神经保护功能仍有待阐明。本研究的目的是，应用脊髓损伤小鼠模型，检测脊髓损伤后应用雷帕霉素治疗是否抑制mTOR信号通路，促进细胞自噬。我们还研究了脊髓损伤后，应用雷帕霉素治疗是否可降低脱髓鞘，神经元减少和细胞死亡等神经组织损伤，以及是否提高运动功能恢复。
我们在这里展示，在损伤的脊髓组织应用雷帕霉素治疗可通过抑制mTOR通道显著提高自噬活动。此外，雷帕霉素显著减少脊髓损伤后的神经组织损伤和提高运动功能。因此，应用雷帕霉素可能是一种新的治疗脊髓损伤的策略。
方法：
实验动物
所有的实验程序，通过日本东北大学动物管理和使用委员会的批准。所有的努力都是尽量减少实验动物的用量，并在研究中尽可能地减少动物的痛苦。共58只成年C57BL/6J雌性鼠（10-12周龄）用于本实验。在每个时间点每组实验用四个或五个动物。老鼠在24℃条件下饲养，每笼3或4只，术前术后均自由饮食。
脊髓挫伤模型
将 1.25％氟烷混合于氧/氧化亚氮（30/70％）的混合气体中麻
醉小鼠。手术过程中，通过一个加热垫监测和维持直肠温度在37.0±0.5 ℃。脊柱区皮肤去毛并用消毒液清洗。沿中线切开皮肤15毫米，暴露T8到T12的椎板。在T10行椎板切除术，露出带完整硬脑膜的背部脊髓。脊柱用互成角度的夹子夹住T8和T12的横突一保持稳定。脊髓损伤的模型制作应用改良的纽约大学脊髓打击器(Bassoet al., 1996; Gruner, 1992; Hashimoto et al., 2007; Kanno et al.,2009a; Kim et al., 2001; Okada et al., 2004)。重量10g的打击棒（顶端直径1.5mm）从3mm高出落在T10脊髓节段上。肌肉和皮肤分层闭合。每天挤压膀胱两次直到自主排尿。对假手术动物进行了同样的手术程序，但没有打击脊髓。
雷帕霉素的制备和用药
雷帕霉素（Calbiochem公司）溶解在二甲基亚砜（DMSO）（25毫克/毫升）中，并进一步稀释在0.5毫升含有5％的聚乙二醇400和5％的失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚（Tween 80简称乳化剂T-80）的水溶液中，配制后立即注射。SCI4小时后，雷帕霉素治疗组的小鼠，腹腔内注射雷帕霉素，剂量为1毫克/公斤体重。对照组小鼠注射等体积的溶剂。
行为分析
为了评估SCI后的功能，制定了应用后肢运动功能评分（BMS）的等级评定表(Basso et al., 2006; Engesser-Cesar et al., 2005)。这个标准是专门为小鼠制定的，因为小鼠与大鼠的运动恢复的特性是不同的。我们也分析了BMS的分项分数，因为一些动物可以改善某方
面的运动功能，而不遵循典型的模式恢复，并因此不会反映在BMS总得分上(Basso et al., 2006)。在手术前，将小鼠单独放置在一个设定的开放的塑料区域4分钟，以确保所有实验对象获得最大得分值。小鼠被放置在开放的领域，受过训练研究员以双盲的方式评测小鼠的的BMS分值。在SCI后4 h和24 h，3，7，14，21，28，35，和42天测得BMS分值。
Western blot检测
在SCI后24小时或3天处死小鼠，取出脊髓组织。脊髓放于裂解缓冲液中，裂解液包括50mM Tris HCl（pH值7.6），20mM氯化镁，150mM的NaCl，0.5％的Triton-X，5单位/毫升抑肽酶，5微克/毫升亮肽素，5微克/ mL胃酶抑素，1mM苄脒，1mM苯甲磺酰氟。离心去除残余脊髓组织，根据BioRad 蛋白浓度测定手册测定溶解液中的蛋白水平(Bio-Rad Laboratories, GmbH, Munich, Ger-many)。溶胞产物中的蛋白质，在15％凝胶上通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，然后电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。对膜进行封闭1 h在TBST缓冲液中（pH为7.5的0.01M的Tris盐酸，0.15M NaCl 和0.05％吐温20）含有3％的牛奶，和孵育兔抗hospho p70S6K的抗体（1:1000，Cell Signaling公司），兔抗-LC3的抗体（1:500; MBL）或稀释的兔抗-Beclin 1的抗体（1:100，Santa Cruz Biotechnology 公司），在4℃下， TBST缓冲液中过夜。将膜洗涤三次，并在室温下放于与辣根过氧化物酶（1:1000; Invitrogen公司）结合的二抗中孵育1小时。免疫反应的条带，应用增强的化学发光试剂（Amersham
公司）和数字化的LAS-1000 Pro（FUJIFILM，东京，日本）显影。应用扫描密度分析和图像J 1.42q软件程序对定量条带的密度（美国国立卫生研究院）。用β微管蛋白对条带密度的数量进行标准化，然后，这些数量值与雷帕霉素处理组，溶剂处理组和假手术对照组进行比较。
组织制备
脊髓损伤后3天及42天，向小鼠腹腔内过量注射100毫克/公斤的戊巴比妥钠。小鼠穿心灌注生理盐水，然后置于由4％的多聚甲醛和0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合的pH 7.4混合液中。用于免疫组化染色的脊髓节段，含损伤部位一起收集后固定在相同的固定液中4℃过夜，之后用石蜡包埋。围着受伤的部位切取7微米厚的切片装于玻片上。连续切取9个周长250微米的切片，跨越脊髓损伤中心部位2000微米的长度。如在描述的是用于免疫组织化学染色的切片制备。
免疫组织化学
免疫组化染色检测LC3和自噬基因Beclin1使用SCI 3天后的切片。切片脱蜡后再水化，然后在PBS中洗涤10分钟，然后用PBS含有0.3％聚氧乙烯去水山梨醇洗涤10分钟，，并用含3％的乳剂和5％牛胎儿血清（FBS）的0.01M的PBS冲洗2小时。切片置于PBS稀释的兔抗-LC3的抗体（1:100; MBL），兔抗-Beclin 1的抗体（1:100;圣克鲁斯生物公司）或鼠标的anti-NeuN抗体（1:100，Chemicon公司）中4℃过夜。用PBS冲洗后，将切片与山羊抗兔IgG的Alexa
Fluor594二抗（1:500，Molecular Probes公司）或山羊抗小鼠IgG 的Alexa Fluor488的二抗（1:500，Molecular Probes公司）中，在室温下孵育1小时。切片包埋于含DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的Vectashield中标记细胞核。在每个实验中，在同一时间对切片进行染色。
LC3阳性细胞和Beclin 1的阳性细胞计数
免疫组织化学染色LC3和自噬基因Beclin1后对每个切片均使用激光显微镜（(BX 51;Olympus, Tokyo, Japan)）扫描。切片的扫描图像在含有网格的6.0版本的Photoshop Elements软件程序监视器上显示。然后使用手动的计数器对LC3阳性细胞和Beclin 1阳性细胞进行计数。LC3-阳性细胞被定义为这些显示点状LC3的荧光点(Kabeya et al., 2000; Rami et al., 2008)。对打击中心部位以及头侧250微米和尾侧500微米部位的切片进行LC3-阳性细胞和Beclin 1的阳性细胞的计数。雷帕霉素处理组，溶剂处理组与假手术对照组之间分别比较五个部位切片的细胞计数量。
白质染色
SCI后42天取脊髓打击中心250微米处的脊髓组织切片，将这些7微米厚的切片行脊髓luxol fast blue染色。luxol fast blue染色最轻的部分被作为损伤中心。一共有9个连续的部分，横跨2000微米脊髓长度，其中评估了包括打击中心头侧和尾侧各四个切片。染色切片的图像由数字照相机捕获，并使用图像j1.42q软件程序分析白质区的脊髓。进行luxol fast blue染色后，白质出现暗的蓝色和与
健康的神经组织相同的细胞结构。损坏或退化的白质变得苍白或被有明显的嗜碱性核细胞群的瘢痕组织取代(Baoet al., 2011; Joshi and Fehlings, 2002; Steward et al., 1999)。我们对雷帕霉素处理组和赋形剂处理组的白质区分别进行了分析。
TUNEL阳性细胞计数
为了检测由细胞死亡引起的脊髓损伤的DNA片段，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）染色，应用原位细胞凋亡检测试剂盒（Roche公司，德国曼海姆）对伤后3天的横截面脊髓切片进行检测。用BX51显微镜扫描损伤中心头侧和尾侧250微米处标记的切片。对每个部分中的TUNEL阳性细胞的数量进行计数。TUNEL阳性细胞被定义为用TUNEL和DAPI双标记的细胞。细胞计数过程是相同的，以前所描述的。对雷帕霉素处理组和溶剂处理组中每个动物三个部分中的细胞计数均进行比较。
统计分析
LC3-阳性细胞，Beclin1-阳性细胞，TUNEL阳性细胞数量有显著差异， Western印迹分析得到的条带，均使用配对t检验。采用Mann-Whitney's U检验对每个时间点BMS得分的差异进行检验。在所有的分析，p值<0.05为差异有统计学意义。所有的统计分析采用GraphPad Prism 5.0a的软件程序(GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA)。
结果：
BMS运动功能评分
为了评估雷帕霉素治疗脊髓损伤后的运动功能恢复的影响，测量了6个星期的BMS总分和单项分(Fig. 1 A, B)。雷帕霉素处理组和溶剂处理组的BMS总分在损伤后4小时后增加，在损伤后28后内达到平台。
FIG. 1.Ａ，Ｂ
损伤后14天到42天，雷帕霉素治疗的小鼠的BMS的总分数的
平均值始终高于溶剂对照组的。损伤后21天到42天，雷帕霉素治疗的小鼠的BMS分数显著高于溶剂对照组。损伤42天后，雷帕霉素治疗的小鼠的BMS总分值的得分为7-9（8.4 ±0.4）。42天的时候，除一组雷帕霉素处理的小鼠BMS为7分外，其他四个雷帕霉素治疗组小鼠均达到协调步态，或者有轻微的不稳。另一方面，溶剂处理组的小鼠的BMS分数分别为5-8（6.8±0.5）。五分之四溶剂处理组的小鼠行进时不能保持足部平行，或者表现出严重的躯干不稳定，如倾斜，蹒跚，或倾倒。雷帕霉素处理组和溶剂处理组小鼠的BMS单项得分在损伤24 h后均增加，并在损伤后28天达到了平台。损伤后14天至42天，雷帕霉素处理组BMS单项得分平均始终高于溶剂处理组。损伤后14天至42天，雷帕霉素处理组BMS总得分明显高于溶剂处理组。
p70S6K的磷酸化
为了研究mTOR信号通路在小鼠体内的雷帕霉素治疗的有效性，应用Western blotp对70S6K的磷酸化进行分析评价。伤后24小时到3天，雷帕霉素处理组p70S6K蛋白的磷酸化较溶剂处理组和假手术对照组有所减少(Fig. 2A)。
