质粒与载体(6)

骤雨初歇 分享 2021-04-05 下载文档

质粒与载体

缺失型的大肠杆菌中。利用了这种载体与宿主的基因互补,pUCs改善了选殖株筛选的方式。何况在培养基中加乳醣分解?基因的诱发物(inducer)IPTG(isopropyl-1-thio-β- D-galactopyranoside),更可诱发乳醣分解?大量表现。你只要看颜色就能鉴别选殖株与非选殖株。


载体pBluescripts(如pBluescript II KS(+)、pBluescript II KS(-),(Alting-Mees and Short, 1989))则是利用pUCs做了DNA 不同形式生产的进一步发展。它的特点是结合了pUCs的质粒载体特色与线状噬菌体的DNA 复制特色,故称为phagemid。线状噬菌体(filamentous phage)是一群以线状单链DNA 为基因体,以大量单一种类蛋白质(B蛋白)呈螺旋状包裹的极细长噬菌体。它们藉由性线毛的协助感染宿主,基因体进入宿主后会环状化(circulization)并复制互补链成为双绞链。DNA 复制以rolling circle方式产生大量单链基因体DNA 。基因体DNA 被壳蛋白包裹后从宿主中「穿出」,并不会杀死宿主。将线状噬菌体f1的复制原切出植入质粒中并不会影响质粒的复制。但如果以适当的helper线状噬菌体感染含有phagemid的宿主时,phagemid就会产生大量的单链DNA 。这些phagemid单链DNA 也会被包入噬菌体壳蛋白中,并且包入的单链DNA 与当初f1复制原在phagemid上的方向有关(+或-)。如此你就可以从宿主细胞中纯化phagemid双链DNA 从事选殖等用途;从噬菌体中纯化单链DNA 从事定序工作。

载体pETs(如pET12a、pET25b,Moffatt and Studier, 1986)则是结合了pBR322、pUCs或pBluescripts等的载体功能与噬菌体T7的基因调控。它的命名与外星人ET无关,而是结合了expression和T7 system。T7是溶菌型噬菌体。它在感染大肠杆菌后,首先利用宿主RNA 聚合?及核醣体制造出包含T7 RNA 聚合?及T7蛋白激?(protein kinase)等噬菌体早期蛋白。T7蛋白激?将宿主RNA 聚合?磷酸化使之失去活性;T7 RNA 聚合?马上接管宿主细胞中所有的转录工作。T7 RNA 聚合?是一条多胜链(single polypeptide)构成,只认识T7启动子不认得宿主启动子。载体pETs是将T7特有的启动子切出插入适当的载体中,利用这个启动子来启动欲表达的基因。至于T7 RNA 聚合?则是选殖入乳醣分解?基因启动子的后方,以λ噬菌体带入适当的宿主细胞内。当我们在培养基中加入IPTG诱发T7 RNA 聚合?的大量制造时,大量的T7 RNA 聚合?就转而大量地转录我们欲表达的基因。利用这种方式可以大量生产选殖在
T7启动子后方的基因产物。生产量竟然能达到大肠杆菌蛋白质总量的1/10呢!这种载体称为表达载体(expression vectors)。在生理学、遗传学及研究经验上,大肠杆菌及它的质粒和噬菌体都是我们最熟悉的。分子生物学及基因选殖也是从大肠杆菌开始发迹。基于这些原因,无论我们选殖动、植物


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