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2013-2014分子生物学复习资料
一、中心法则
DNA RNA 蛋白质
二、DNA复制
(一) DNA复制的特点
1、半保留复制
DNA复制时分别以两条亲代链作为模板链通过酶催化各形成一条子代链，亲代链分开处即子代链合成处成为复制叉。 2、半不连续复制
DNA亲代链5’到3’方向的复制时，是以小片段的形式从5’到3’不连续的复制形成冈崎片段，再经DNA连接酶连接形成一条链。 3、RNA的引导
RNA的引导保证DNA复制的高忠实性。 （二） DNA复制所需要的酶 1、原核中：
（１）DNA解旋酶：利用ATP水解的能量解开双链ＤＮＡ
（２）DNA旋转酶（Ⅱ型拓扑异构酶）：引入负超螺旋从而释放正超螺旋。 （3）DNA聚合酶Ⅲ：延伸前导链和后随链中的引物。 （4）DNA聚合酶Ⅰ：切除引物。
（5）DNA连接酶：连接冈崎片段形成ＤＮＡ子代链。 2、真核中：
（１）DNA聚合酶α：前导链和后随链的每个片段都是利用其引发酶活性从RNA引物开始。
（２）DNA聚合酶δ：在前导链上替代前一种酶继续延伸。 （３）DNA聚合酶ε：在后随链上完成DNA的复制。 （三） DNA聚合酶
1、真核中：真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶α（定位于胞核，参与复制引发具5－3外切酶活性），β（定位于核内，参与修复，具5－3外切
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酶活性），γ（定位于线粒体，参与线粒体复制具5－3和3－5外切活性），δ（定位核，参与复制，具有3－5和5－3外切活性），ε（定位于核，参与损伤修复，具有3－5和5－3外切活性）。
2、原核中：原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
功能 聚合作用5'→3' 外切酶活性3'→5' 内切酶活性5'→3' polⅠ polⅡ polⅢ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － ＋ 焦磷酸解和焦磷酸交换作用 ＋ 完整的DNA双链 带引物的长单链DNA 带缺口的双链DNA 双链而有间障的DNA 分子量（ｋｄ） （四）DNA的损伤与修复 1、诱变 （1）突变
1) 点突变：一个单一碱基的改变
－ ＋ ＋ ＋ 109 120 140 转换：嘌呤与嘌呤之间或是嘧啶与嘧啶之间 颠换：嘌呤与嘧啶之间或是嘧啶与嘌呤之间
2) 沉默突变：突变发生在ＤＮＡ的非编码区、非调节区或密码子的第
三个碱基位置，不影响掺进蛋白质中的氨基酸 3) 错义突变：突变改变了基因产物的一个氨基酸
4) 移码突变：插入或缺失涉及一个或多个碱基的增加或丢失
（２）物理诱变：高能离子化辐射，如Ｘ射线、γ射线、紫外线（嘧啶二聚体是常见的一种产物）
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（３）化学诱变：碱基类似物（直接诱变）、亚硝酸、烷化剂等 ２、损伤 （１）氧化性损伤
（２）烷基化（如ＭＭＳ、ＥＮＵ） （３）聚化加合物 ３、修复
（１）光复活：在可见光下，ＤＮＡ光解酶可将环丁烷嘧啶二聚体再分解为单体 （２）烷基转移酶
（３）切除修复：核苷酸切除修复和碱基切除修复 （４）错配修复 （５）遗传性修复 （五）ＤＮＡ的克隆 １、ＤＮＡ的制备 （１）质粒DNA的制备
碱裂解法：从染色体ＤＮＡ及大部分其他细胞成分中纯化 酚抽提法：采用酚或酚－氯仿混合物进行抽提 乙醇沉淀： 氯化铯梯度法：
（２）噬菌体DNA的制备 2、载体 （1）质粒载体
1) 插入失活原理：pBR322及其衍生物包含两个抗生素抗性基因，ampr
和tetr，当目的基因插入其中一个时，会导致该基因失活。 2) 蓝白斑筛选：在质粒中含有LacZ基因（编码β-半乳糖苷酶，受Lac
启动子的调控）的α-肽的序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达α-肽，它与宿主菌的Lac ZM15基因的产物互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；外源基因插入后，肽基因阅读框架被破坏，细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色（阳性克隆）。
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（2）噬菌体载体
噬菌体颗粒将其线性DNA注入细胞，进而DNA连成环状，其后该DNA被复制组装成噬菌体颗粒，经裂解细胞释放到胞外，造成细胞死亡，或通过特异位点将其DNA整合到宿主基因组，而获得长期插入。 （3）其他载体
黏粒载体：利用λ噬菌体cos位点 YAC：酵母人工染色体 BAC：细菌人工染色体 （六）基因文库
1、基因组文库（DNA来自基因组DNA）
N?ln(1?p)1n(1?f)，p代表给定概率，f是插入片段大小占总基因大小的
文库的大小比例。
2、cDNA文库（DNA来自群体mRNA的拷贝） cDNA第二条链的合成：
a) 自身引物合成法：cDNA/mRNA杂合体用碱处理后获得单链cDNA，随即在3’
端形成一个短小的发夹结构，次发夹结构可以作为引物合成第二条链。最后用SI核酸酶处理除去末端发夹结构，但5’端部分序列会因此而失去。 b) 置换合成法：RNaseH在mRNA上产生缺口（内切作用）残存的ＲＮＡ可以作
为合成第二条链的引物，最后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接修复缺口。通过这种方法可以获得近乎全长的dscDNA。
c) 引导合成法：NaoH降解杂交链中的mRNA，然后用末端转移酶在cDNA３＇端
加聚Ｃ尾巴，以Oligo（dG）为引物合成第二条链，这种方法可获得全长的dscDNA。 (七)DNA测序
1、双脱氧链终止法测序的原理
DNA聚合酶能利用单链ＤＮＡ为模板，离体合成其互补链，当反应液中２＇，３＇－双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ），它可以像２＇－脱氧核苷三磷酸（ｄＮＴＰ）那样直接掺入新合成的ＤＮＡ链中，但因ｄｄＮＴＰ３＇端不具－ＯＨ，所
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以寡核苷酸链不再继续延长，即ＤＮＡ链合成终止。在４个反应管中同时加入同一种合成ＤＮＡ的被标记的引物和待测序的ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶１、４种脱氧核苷三磷酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ），并在这４个管中分别加入４种不同的２＇，３＇－双脱氧核苷三磷酸。反应将产生不同长度的DNA片段混合物，他们都带有ddNTP的3’末端。将这些混合物进行变性凝胶电泳分离，就可以获得一系列不同长度的DNA普带。再通过放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。最后可以在放射性Ｘ光底片上，直接读出ＤＮＡ序列。 2、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ化学降解法：
首先放射性标记待测序ＤＮＡ的一端，并将其分为４份，分别用不同的化，学试剂进行４种裂解反应，每种反应之断裂某一种或某一类碱基，结果可产生４种起始于放射性标记末端的不同长度的标记分子，经变性ＰＡＧＥ凝胶电泳分离各组不同大小长的ＤＮＡ片段，并进行放射自显影，可根据Ｘ光片上所显现的相应普带，读出ＤＮＡ的核苷酸序列。 3、ＤＮＡ的自动测序：
基于双脱氧链终止法测序原理，也是通过４个酶学反应利用ｄｄＮＴＰｓ产生一系列一端固定、另一端终止于不同Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ碱基位点的DNA片段。
三、RNA转录
乳糖操纵子
1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。
2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。
3、CAP（ｃＡＭＰ受体蛋白）的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP
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