月城°课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
学习目标：1.明确用培养基对微生物进行选择的原理。(重点) 2.学会统计微生物数量的方法。(重点) 3.能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。(难点)
1．研究思路 (1)筛选菌株的思路 ①自然界中目的菌株的筛选
ⅰ依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
ⅱ实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。
②实验室中目的菌株的筛选
ⅰ原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
ⅱ方法：利用选择培养基分离。
a．选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。
b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
(2)统计菌落数目
①常用方法：稀释涂布平板法。
?? 生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的ⅰ原理? 一个活菌
b.通过统计平板上的菌落数来推测样品中?? 大约含有的活菌数
ⅱ计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。 C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。 V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。 M：代表稀释倍数。 ⅲ注意事项
a．为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。
a.当样品的稀释度足够高时，培养基表面
b．统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
c．设置对照：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
②其他方法：利用显微镜直接计数。 2．实验设计及操作提示 (1)实验设计 ①土壤取样
从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约3～8 cm的土壤层取样。
②样品的稀释
ⅰ稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。
ⅱ稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300之间，便于计数。
ⅲ微生物的培养与观察
a．培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
b．观察：每隔24_h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 (2)操作提示 ①无菌操作
ⅰ取土样的用具在使用前都需要灭菌。
ⅱ应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 ⅲ在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
②做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好标记。 ③制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。 (3)菌种鉴定
①原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。 ②方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
1．判断对错
(1)因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离。
( )
(2)测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同。
( )
(3)如果得到了两个或两个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
( )
(4)牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显少于选择培养基上的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌种。
( )
提示：(1)√ (2)√ (3)√ (4)× 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显大于选择培养基上的菌落数目，才说明选择培养基具有筛选作用。
2．产生每个标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( ) A．一个细菌，液体培养基 B．许多细菌，液体培养基 C．一个细菌，固体培养基 D．许多细菌，固体培养基
C [在微生物的培养中产生每个标准菌落的细菌的最初数目是一个细菌，使用的培养基为固体培养基。]
[合作交流] 1．根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？ 提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。 2．如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按照公式进行计算。
3．稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。 提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
[归纳总结]
1．选择培养基的选择作用
(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
(2)方法：
①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高
微生物的筛选与计算
