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分光光度法介绍
分光光度法是利用溶液中特定溶质的光吸收测定其浓度的方法，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。 一 Lambert定律
当一束平行单色光垂直照射于一均匀物质溶液时，溶液将吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则在溶液中的光程越长，光线强度的减弱也越显著。 设：入射光强度为I0，透射光强度为I，L代表光在溶液中的光程。 I0
lg =K1L I
K1是常数，受光线波长，溶液性质，溶液浓度影响。 二 Beer定律
当一束光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若光程不变，则溶液的浓度越大，光吸收越强，透射光强度的减弱也越显著，光线减弱的比例与溶液浓度呈正比。 I0
lg =K2C I
K2为吸收系数，是常数。溶液对光吸收的强弱与溶液浓度C成正比。 三 Lambert-Beer定律 将以上两个定律合并： Io
lg =KCL I
IoI
令A=lg T= 则A=KCL=-lgT
IIoT为透光度，A为吸光度，K为消光系数
四 待测样品浓度的计算 A标=KC标L A样=KC样L 由于是同一物质及相同的光程，则：
A样/A标=KC样L/KC标L=C样/C标 即：C样=（A样/A标）*C样 故已知标准溶液的浓度及吸光度，依据公式可计算出待测样品溶液的浓度。
一 实验名称： BCA法测定蛋白质含量 二 实验原理：
BCA即二奎碄甲酸。在碱性条件下，蛋白的肽键结构将二价铜离子还原为亚铜离子，亚铜离子与BCA试剂形成稳定的紫色络合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。 三 实验步骤：
A 标准品的稀释：
将9支干燥的1.5ml离心管编号，按表加入下列试剂：
1.2ml离心
管 A B C D E F G H I
BCA法标准曲线和样品测定
ddH2O（μL2mg/mLBSA（μL蛋白质终浓度（μg/m
L) ） ）
0 50μL标准品 2000 125 375μL标准品 1500 325 325μL标准品 1000 175 175μLB管混合液 750 325 325μLC管混合液 500 325 325μLE管混合液 250 325 325μLF管混合液 125 400 100μLG管混合液 25 400 0 0=Blank
B 配置BCA工作液：
依据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50:1配制适量BCA工作液，并充分混匀。 C 标准品及样品的测定：
1）分别取25μL上表中新鲜配制的BSA标准液和待测样品，加入到微孔板中； 2）每孔中加入200μLBCA工作液，并充分混匀；
3）加盖，37℃孵育30min后冷却至室温或室温放置2h； 4）以I号管调零点，于562nm处测定各管吸光度
5）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的蛋白浓度。 四 实验结果： 实验数据如下： STANDARD （加粗数据是样品吸光度）
A C 1.831 1.951 2000 1.337 1.457 1500 1.031 1.251 1000 750 0.611 0.755 500 0.329 0.449 250 0.162 0.282 125 0.049 0.169 25 0 0.12 0 0.603 0.723
21.510.5005001000150020002500y = 0.0009x + 0.06882R = 0.9912系列1线性 (系列1)
将样品数据代入方程：得出：x=726.89μg/mL，即样品中的蛋白质浓度为726.89μg/mL 五 讨论：
1从标准曲线中可以看出，溶液的蛋白质含量和吸光度成正相关，蛋白质含量越高，吸光度就越高。
2 配制溶液时一定要细心，不要配错，正确使用移液枪，及时换枪头，避免污染； 3 当离心管中已经注入溶液，小心不要因为过失而导致其漏液，造成损失； 4 测定吸光度时注意调整波长；
5 该方法快速，灵敏度高，试剂稳定性好，对不同种类蛋白质的检测的变异系数小，而且BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中化学物质的影响，低浓度的去垢剂不影响检验结果，在微孔板中进行测定，可以大大节约样品和试剂用量。 6 此种方法的测定范围是20~2000μg/mL
一 实验名称：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量： 二 实验原理：
考马斯亮蓝在酸性条件下和蛋白质结合，使染料最大吸收值从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。测定范围为50μg-1000μg/ml 三 实验步骤：
A 考马斯亮蓝染液在使用前应平衡温度至室温并温和的颠倒混匀； B 标准品的稀释：
将7支干燥试管编号，按表加入下列试剂： 考马斯亮蓝法标准曲线和样品测定 试剂 0 1 2 3 BSA液（μl）2mg/ml 0 5 10 20 PBS(μl) 150 145 140 130 蛋白质终含量（mg/mL) 0 0.067 0.13 0.27 4 30 120 0.4 5 60 90 0.8 6 0 150 0 C 标准品及样品的测定 1）将5μL体积的样品加入到试管中，并用PBS补足到150μL；
2）向各个试管中加入2.85mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5-10min； 3）以0号管调零点，于595nm处测定各管吸光度；
4）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的蛋白浓度。 四 实验结果： 标准曲线：
1.210.80.60.40.2000.51y = 1.0698x + 0.13212R = 0.9803系列1线性 (系列1)
样品对应的吸光度为1.148
将样品数据代入方程：得出：x=949.6μg/mL，即样品中的蛋白质浓度为0.9496mg/mL 五 讨论
1 考马斯亮蓝可以和石英比色皿产生强烈的结合，建议使用玻璃或塑料比色皿；
2 不同的蛋白可以和CBBG的结合程度不同，因此使用被测蛋白作标准曲线，可以得到更准确的结果；
3 应按蛋白浓度从低到高的顺序进行测定，测定过程请连续进行，不要清洗比色皿，因为水质会影响测定结果；
4测定吸光度时注意调整波长；
5从标准曲线中可以看出，溶液的蛋白质含量和吸光度成正相关，蛋白质含量越高，吸光度就越高；
6此种方法的测定范围是50~1000μg/mL；
7使用分光光度计时，每一次打开盖子后，都需要再次矫正，不然会产生误差； 8在使用可见光分光光度计时，注意往装液体时不可过多，以防洒出损伤仪器。也不能过少，可能导致无法测量液体的分光度；
9 由考马斯亮蓝法测得的蛋白质浓度和用BCA法测得的蛋白质浓度有很大差距，原因我们分析有以下几点：
1）我们可能在操作的过程中没有注意细节，比如试管中残留的蒸馏水没有完全除去，或者比色皿中的残留液体没有完全擦干，或者试液加入的量错误等等，这些错误是由我们实验者自身造成的，所以说这次试验并不是很成功，我们实验者要有一部分责任；
2）仪器本身的误差也是客观存在的，比如移液枪的个体差异，有一些会因为枪或者枪头的原因使液体量多或者量少；分光仪器本身的误差等等。
