发酵工程

第一章 总论

1、发酵工程的含义：是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。

2、发酵工业生产流程：①原料预处理；②培养基配制；

③发酵设备和培养基灭菌；④无菌空气的制备；⑤微生物菌种制备和扩大培养；⑥发酵；⑦发酵产品的分离和纯化。

第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术 1、微生物菌种分离方法：①施加选择性压力分离法 ②随机分离方法 ③酶抑制剂产生菌的分离 ④抗病毒药物产生菌的分离 ⑤生长因子产生菌的分离 ⑥免疫激活剂产生菌的分离 ⑦多糖产生菌的分离。

2、微生物菌种选育的方法：①自然选育；②诱变选育；③杂交育种；④原生质体融合。

3、菌种退化：通常是指在较长时间传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。 4、复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性，称为复壮。

5、菌种保藏：①斜面低温保藏法 ②石蜡油封保藏法 ③砂土管保藏法 ④冷冻干燥法 ⑤超低温保藏法。 6、种子制备的过程：①斜面培养基中活化；②扁瓶固体培养基中过摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备；③一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；④种子转种至发酵罐。 7、种子扩大培养的方法：液体深层培养法，深层培养基本操作的三个控制点：①灭菌；②温度控制；③通气、搅拌。 几种深层液体培养法：控制培养法、载体培养法、两步法、放大法、分配培养法、连续培养法、流加法。 8、初级代谢产物：微生物自身生长繁殖所必须的代谢产物，称为初级代谢产物，如氨基酸、核苷酸、多糖、维生素、有机酸、蛋白质、核酸等。

9、次级代谢产物：与微生物生长繁殖无明确关系，称为刺激代谢产物，如抗生素、生物碱、色素等。

10、培养基的配置原则：（1）选择适宜的营养物质；（2）营养物质浓度及配比合适；（3）选择合适的pH；（4）氧化还原点位的影响。

第三章 发酵工业原料及其处理

11、发酵培养基中的营养成分：碳源、氮源、无机盐、生长因子和水，有时还会有前体、促进剂和抑制剂等物质。 前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，直接通过微生物的生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。（如：在青霉素生产中加入玉米浆） 促进剂：那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂。（如巴比妥盐能使利福霉素单位增加。） 抑制剂：抑制其它代谢途径向所需产物途径转化。（如

亚硫酸氢纳是乙醇代谢的抑制剂，促使甘油形成） 12、淀粉水解糖的制备方法

（1）酸解法：以酸(无机酸或有机酸)为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。

优点：生产方便、设备简单、水解时间短，设备生产能力大 缺点：高温高压、酸性条件、过程复杂、副反应多、损失大 要求：淀粉颗粒不宜过大、大小要均匀，淀粉乳浓度也不宜过高。

（2）酶解法（双酶法）：利用专一性很强的淀粉酶和糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。

优点：酶反应条件温和，酶的作用专一性强，副反应少，可在较高的淀粉乳浓度下水解，可用粗原料，糖液颜色浅，较纯净、无苦味、质量高。 缺点：酶解时间长、需要专门的设备，酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。

（3）酸酶结合水解法

a. 酸酶法：是酸先将淀粉水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺 。 如玉米、小麦等谷物原料的淀粉，淀粉颗粒坚硬，所以液化采用酸法。 优点：酸液化速度快，糖化时可采用较高的淀粉乳浓度。

b. 酶酸法：是将淀粉乳先用 淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖。 如碎米淀粉，若用酸水解，往往水解不均匀，出糖率低。

优点：可采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸法高，生产易控制。时间短，淀粉水解副反应少。 13、灭菌的原理和方法：

消毒：杀死物体表面及内部一部分对人体有害的病原菌的

营养体，而对被消毒的物体基本无害的措施，如对皮肤、水果、饮用水的消毒，啤酒、牛奶、果汁等消毒。

灭菌 ：杀死任何物体内外的一切微生物的方法，灭菌后

的物体不再有可存活的微生物。

灭菌方法：干热灭菌法、湿热灭菌法、射线灭菌法、化

学药品灭菌法、过滤除菌法等。

①干热灭菌法：利用高温产生的干热对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用而杀灭微生物。 ②湿热灭菌法：借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。

③辐射灭菌法：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。

④化学药剂灭菌法：利用药物与微生物细胞中的成分发生反应，使蛋白质变性、酶失活。

⑤过滤除菌：利用微生物不能透过滤膜而达到除菌目的。 14、微生物的热死定律——对数残留定律

t = 1/k lnN0/Nt 或 t = 2.303/k lgN0/Nt t—灭菌时间，min

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N0—开始灭菌时原有活菌数（个） Nt—经过t 时间灭菌后的残留菌数（个） K—反应速率常数，min-1 15、连续灭菌的工艺流程：（1）配料预热罐；（2）连消塔；（3）维持罐；（4）冷却管。

第四章 无菌空气的制备

16、空气除菌常用方法：介质过滤除菌法，介质过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。通过过滤除菌处理的空气可达到无菌，并有足够的压力和适宜的温度以供好养微生物培养过程之用。

17、空气预处理的目的：（1）提高压缩前空气的洁净度；（2）去除压缩后空气中所带的油和水。

18、空气过滤除菌的工艺过程：吸入空气→前过滤→空气压缩机→压缩空气冷却至适当温度→分离出去油和水→加热至适当温度，相对湿度为50%~60%→空气过滤器→无菌空气

第五章 氧的供需与传递

1、双模理论：氧气的溶解过程是一个由气相进入液相的过程，为实现这一过程，氧气需要跨过由气-液界面构成的屏障，在界面的一侧有气膜，另一侧为液膜，氧的溶解需要经过这两层膜才能实现。因此，根据这一模型建立起来的气体溶解理论称为双膜理论。

第八章 发酵设备与反应器

1、生物反应器：是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统。

2、密闭厌氧式发酵罐的一般结构：锥形罐（啤酒发酵罐）：锥形罐体、隔热层和防护层、CIP清洗系统 要求：能封闭，能承受一定压力，有冷却设备，罐内尽量减少装置，消灭死角，便于清洗灭菌。酒精等都属于嫌气发酵产物，其发酵罐因不需要通入无菌空气，因此在设备放大、制造和操作时，都比好氧发酵设备简单得多。 （2）筒体直径(D)和筒体高度(H)是主要特性参数。单酿罐一般是D：H＝1：1~2。对两罐法的发酵罐D：H＝1：3~4，对两罐法的贮酒罐D：H＝1：1~2，也有采用直径为3~4m的卧式圆简体罐作贮酒罐。增加H有利于加速发酵，降低H有利于啤酒的自然澄清。

3、好氧发酵罐——机械搅拌型发酵罐：（不用太复杂，知道有哪些部分构成及功能就可以） （1） 罐体

（2） 搅拌装置 作用：打碎气泡，使氧溶解于发酵液中；增加接触界面；延长气液接触时间；有利于传质传热 。搅拌器有轴向式（桨叶式、螺旋桨式）和径向式（涡轮式）两种。

（3） 挡板：通常挡板宽度取（0.1-0.12）D，装设4-6块即可满足全挡板条件（所谓“全挡板条件”是指在一定转速下再增加挡板或其它附件而搅拌功率仍保持不变，漩涡

基本消失。

作用：防止液面中心产生漩涡，改变液流的方向，促使液体激烈翻动，增加溶解氧

（4） 轴封 作用：使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄露和污染杂菌。 安装：旋转轴与设备之间 （5） 传热装置 作用：实消时预热和冷却，发酵过程中的冷却和加热

型式：夹套、竖式蛇管、列管，5M3以下发酵罐一般采用夹套冷却，大型发酵罐一般采用蛇管或列管，易腐蚀或磨损穿孔。

（6） 通气部分 作用：吹入无菌空气，使空气均匀分布 形式：单管及环形管等，常用的为单管式，管口对正罐底中央，装于最低一挡搅拌器下面，管口与罐底的距离约40mm，气速20m/s

（7） 消泡装置 作用：打碎泡沫，防止逃逸 长度：约为罐径的0．65倍。

安装在发酵罐内转动轴的上部或安装在发酵罐排气系统上，可将泡沫打破或将泡沫破碎分离成液态和气态两相的装置，最简单实用的是耙式消泡器。

（8） 进出料口 进料口，补料在罐顶；出料口在罐底。 （9） 测量控制系统：传感器 （10） 附属系统：视镜、取样管等

4、发酵热：发酵过程中产生的热量称为“发酵热”。可由下面的热量平衡方程进行计算：Q = Q1+Q2-Q3-Q4

Q——发酵热；Q1——生物体生命活动产生的热量；Q2——机械搅拌热，搅拌器搅拌液体的机械能转变成的热能；Q3——发酵过程的通风带出的水蒸气蒸发和空气温度上升所需的热量；Q4——发酵罐外壁由于与环境的温差而引起的热量损失。

5、气升式发酵罐原理：把无菌空气通过喷嘴或喷孔喷射进发酵液中，通过气液混合物的湍流作用而使空气泡分割细碎，同时，形成的气液混合物含由于气量多的发酵液密度降低上升，含气量少的发酵液下沉，形成循环流动，实现混合与溶氧传质。

气升式反应器与机械搅拌通风反应器的不同在于无机械搅拌

特点：反应溶液分布均匀，较高的溶氧速率和溶氧效率，剪切力小，对生物细胞损伤小，传热良好，结构简单，易于加工制造。

6、发酵罐的放大：就是使大型发酵罐的性能与小型发酵罐接近，使大型发酵罐与小型发酵罐的生产效率相似。 第九章 发酵过程工艺控制

1、最适生长温度：微生物生长迅速繁殖最快。

最适发酵温度：是既适合菌体生长，又适合代谢产

物合成的温度。

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2、泡沫对发酵的影响和消除：

影响：①降低生产能力；②造成大量逃液，引起原料浪费；③引起染菌；④影响菌的呼吸。

消除：（1）调整培养基成分，改变发酵工艺；

（2）采用机械消沫或消沫剂消沫：Ⅰ机械消泡法：利用机械振动或压力变化使泡沫破裂。罐内消泡: 靠罐内消泡浆打碎泡沫；罐外消泡: 发酵液引出发酵罐外消泡。

Ⅱ化学消泡法：机理：泡沫局部表面张力降低导

致泡沫破灭，降低液膜的机械强度，降低液膜的表面粘度。 3、补料的原则：补料的原则在于控制微生物的中间代谢，使之向着利于产物积累的方向发展。

第十章 发酵染菌及其防治

1、发酵染菌：是指在发酵培养过程中侵入了有碍生产的其他微生物。 （1）种子培养期染菌

由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。

（2）发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。 原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。

措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。 （3）发酵中期染菌

发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。

措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。

（4）发酵后期染菌

发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。

第十一章 发酵工程下游技术发展及发酵液的预处理 1、下游技术：也称为下游工程或下游加工过程，是对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物

原料，经提取分离、加工并精制为目的成分，最终使其成为产品的技术。

2、发酵工程下游技术一般工艺过程：

①发酵液或培养液的预处理与固液分离（或称不溶物的去除）；②初步分离在（或称产物的提取）；③高度纯化（或称产物的精制）；④成品加工。

3、 发酵工程下游技术的总体目标是高产率和低技术。 4、 凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电

排斥作用降低，电位下降，使胶体体系不稳定的现象。 5、絮凝：指在某些高分子絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚合电解质）存在下，使胶体粒子交联成网，形成较大絮凝团的过程。

第十二章 微生物细胞破碎原理与技术

1、 固体剪切法，又称珠磨法

原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径<1nm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞使细胞破碎，释放出内含物。

优点：设备通用性强、破碎率高、操作时间短、成本低、适于大规模生产。 缺点：固---液分离较困难。 2、液体剪切法

原理：利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，使细胞破碎。细胞在一系列高速运动中经历了剪切、撞击和由高压到常压的改变，造成细胞破碎。操作的条件根据菌体种类、浓度和酶的位置而定。 优点：细胞经历了高速造成的剪切、碰撞、高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。

缺点：较容易造成堵塞的丝状真菌、放线菌以及较小的G+菌不适合用本法 项目 液体剪切法 固体剪切法 操作参数 少 多 冷却情况 无或另行冷却 有夹套等冷却方式 破碎率 多次循环后可达到一次操作即可达到较好效果 较好效果 适用范围 不适于丝状真菌和广泛适用于微生物有包涵体的工程菌 细胞 大规模操作 可行 难度大 第十三章 发酵产物分离原理与技术

1、盐析法：又称中性盐沉淀法，在发酵液中加入中性盐能破坏蛋白质或酶的胶体性质，消除微粒上的电荷，促使蛋白质或酶沉淀，此法一般应用于蛋白质分离和酶制剂工业的发酵液提取。

盐析：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低产生沉

淀的现象

2、盐溶：向蛋白质的水溶液中逐渐加入电解质时，开始阶段蛋白质的活度系数降低，并且蛋白质吸附盐离子后，

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带电表层使蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却增强，因而蛋白质的溶解度增大，这种现象称为盐溶。

3、离子交换作用：是指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里溶液称流动相，而固体称固定相。

萃取：指任意两相之间的传质过程。利用化合物在两

种互不相溶的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中的方法。 4、超临界流体萃取的基本原理

超临界流体萃取分离过程是利用其溶解能力与密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，流体与待分离的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小、沸点高低和分子质量大小的不同成分萃取出来。然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则自动完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，并将萃取分离的两个过程合为一体。

5、双水相萃取技术：又称水溶液双相分配技术，其原理是目的物在不相溶的聚合物或无机盐溶液形成的两相中分配系数不同，从而进行分离。其理论基础是表面自由能和表面电荷的影响。

7、常见双水相体系：高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简称Dextran)；

高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。

8、胶团：分散质粒在1nm—100nm之间的分散系 9、反胶团或逆胶团：是两性表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。

10、超滤：凡是能截留相对分子质量在500以上高分子的膜分离过程叫超滤（UF）。

11、微孔过滤：微孔过滤（MF）主要用于分离流体中尺寸为0.1~10μm的微生物和微粒子，以达到净化、分离和浓缩的目的。

12、纳米过滤：是介于超滤和反渗透之间，以压力差为推动力，从溶液中分离出300～1000相对分子质量物质的膜分离过程。

第十四章 发酵产物的纯化原理与技术

1、蒸发的分类，按照对所生产的二次蒸汽是否利用分为单效蒸发和多效蒸发。

单效蒸发：二次蒸汽经冷藏后排出的蒸发操作，称单效蒸发

多效蒸发：把二次蒸汽引入另一蒸发器内作为加热蒸汽用，并将多个蒸发器串联起来的蒸发操作称多效蒸发。 2、中央循环管式蒸发器的原理：加热室由加热管束

和中央循环管组成，中央循环管的截面积是加热管束总截面积的40%-100%。在加热管中溶液沸腾向上升，而在中央循环管，由于截面积大，溶液达不到加热管中的温度，于是溶液向下降，即构成液体在内部的循环。

3、结晶的过程：①形成过饱和溶液，过饱和度提供结晶的推动力；②产生晶核；③晶核在良好的环境中长大。 4、真空冷冻干燥的原理：把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中。

第十五章 发酵工业废物、废水处理和资源化技术 1、资源化技术的定义：

2、单细胞蛋白：又称微生物蛋白或菌体蛋白，是一些单细胞或具有简单构造的多细胞生物菌体蛋白的统称。 3．活性污泥法的原理：利用悬浮生长的微生物絮体处理有机废水的一类好氧生物处理方法。

第十六章 清洁生产技术

1、清洁生产技术的概念：清洁生产是指将综合预防的环境策略持续地应用于生产过程和产品中，以便减少对人类和环境的风险性。

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