loading泰山学院生物科学与技术系实验教案
微生物实验室 教师姓名：年月日 实实验课程 微生物学 专业和班级 验 后记 实验名称 试验二细菌的简单染色和革兰氏染色 实验 类别 实验 目的 实验 重1. 微生物涂片、染色的基本技术。 点 2. 显微镜（油镜）的使用方法。 与 3. 无菌操作技术。 难点 实一、试验原理 验 细菌个体微小，观察个体形态时，一般必须经过染色。微生物的染色方法很过多，各种方法所应用的染色剂也不尽相同，但是一般染色都要通过制片及一程 套染色操作过程。 1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。 2. 巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。 基础实验 课时 3 与 (一)制片与染色的一般操作程序： 内1. 制片 容 在干净的载玻片（平时放在95%酒精中）上滴一滴蒸馏水或无菌水，用接种工具进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中与水混合做成悬液并涂成直径约1cm的薄层。为避免因菌数过多聚成菌团而不利观察个体形态，可在载玻片一端再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。若材料为液体培养物或 自固体培养物中洗下制备的菌液，则可直接涂布于载玻片上，也可根据菌体浓度进行适当稀释后涂布于载玻片。涂布要均匀，菌体间少重叠。因为制片是染色的关键，如不注意菌体涂布的均匀度，会造成染料的大面积堆积，而使观察结果不理想。 2. 干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干燥得快些，可将标本面向上，手持载片一端的两边，小心地在酒精灯火焰高处微微加热，使水分蒸实发，但切勿靠火焰太近或加热时间过长，以防标本烤枯而使菌体变形。 验 3. 固定 过标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个。 程 (1) 杀死微生物，固定细胞结构。 与 (2) 保证菌体能更牢固地粘附在载玻片上，防止标本被水洗掉。 内(3) 改变染料对细胞的通透性，因为死细胞的原生质比活细胞的原生质易于容 染色。 固定常利用高温，即手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层尽快地来回通过3—4次，共约2—3秒钟，并不时的以载玻片的加热面触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），待冷却后，进行染色。 以上这种固定法在微生物实验中虽然应用较为普遍，但是应当指出，在研究微生物细胞结构时不适用，而应采用化学固定法。 4. 染色 标本固定后，选择合适的染色剂，视观察的目的采用相应的染色程序。染色时间平均在1—3分钟，染色过程中，整个标本应该全部浸在染液中。 5. 水洗 染色到时后，用细小的水流从标本表面把多余的染料冲洗干净，只留下均匀吸附在菌体上的染料，以获得清晰的视野画面。 6. 干燥 着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸去，然后微热烘干，以备显微镜观察用。 (二) 革兰氏染色法 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。 细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染（以增加染料与细胞的亲和力）后，用酒精或丙酮脱色，再用复染剂染色。不被脱色而保持原染料颜色者为革兰氏阳性菌(G+)；被脱色而后又被染上复染剂的颜色者为革兰氏阴性菌（G—）。此法可将细菌分成两大类。 革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用乙醇或丙酮脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上 实复染剂的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多且交联度大，类脂验 质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖的孔径变小，通透性降低，因此细过胞仍保留初染时的颜色。 程 二、方法与步骤： 与 1. 简单染色 内单染色一般经过五个步骤：涂片 → 固定 → 染色 → 水洗 → 干燥 容 具体操作程序请参见原理中“制片与染色的一般操作程序”所述。染色剂采