loading2. 请设计一个实验证明线粒体蛋白合成之后进入了线粒体（答案）
答: 可通过基因工程和分子生物学方法进行研究，主要过程如下： ①克隆线粒体基质蛋白基因;
②在无细胞系统中合成酵母线粒体蛋白;
③检测分离后将合成的蛋白质分成两组,一组直接加入胰蛋白酶,另一组先加入线粒体,然后再用胰蛋白酶蛋白酶处理;
④结果分析: 如果加入线粒体的一组中的蛋白质对胰蛋白酶具有抗性,而不加线粒体的一组中蛋白质被胰蛋白酶水解, 即可证明加入线粒体后, 线粒体蛋白进入了线粒体。因为胰蛋白酶是水溶性的酶,不能进入线粒体,所以对胰蛋白酶的抗性说明线粒体蛋白进入了线粒体从而得到保护。
实验过程示于图7E-1。
图7E-1 线粒体蛋白前体转运的实验证明
3. 科学家是怎样证明线粒体基质蛋白在转运过程中穿膜中间体的存在？如何证明导序列(导肽)没有特异性? （答案）
答: 主要是通过离体实证实了穿膜中间体的存在,并证明导向序列对所引导的蛋白质没有特异性(图7E-2)。
首先利用DNA重组技术构建一个嵌合蛋白，其N-端含有一个长为31个氨基酸的线粒体基质导向序列,其后接上一段间隔序列,长度为51个氨基酸,紧接着是187个氨基酸组成的小
鼠二氢叶酸还原酶(DHFR),该酶在正常情况下存在于胞质溶胶中,并且它的C-末端可在分子伴娘的作用下处于非折叠状态。用无细胞系统合成的DHFR嵌合蛋白能够被转运到线粒体基质,然后切除导向序列。氨甲蝶呤(methotrexate)是DHFR抑制剂,它能够与嵌合的DHFR的活性位点牢牢地结合,使嵌合DHFR锁定在折叠状态而不能进入线粒体基质。但是N-端的导向序列能够进入线粒体基质,并被水解,此时的DHFR仍然被结合在膜上形成稳定的转运中间体。这一实验中,间隔序列的设计非常重要,如果间隔序列较短,譬如说35个氨基酸,就得不到稳定的转运中间体。当除去氨甲蝶呤,嵌合DHFR就能完全进入线粒体基质。
这一实验同时证明了导肽没有特异性。
图7E-2 线粒体蛋白转运中间体的证明
(a)通过重组DNA技术构建的嵌合蛋白的结构。(b)转运中间体的证明。氨甲蝶呤是DHFR的抑制剂,它能够同DHFR的活性位点结合,使DHFR不能解折叠,因而不能穿过运输通道,维持转运中间体的状态,这种状态能够通过电子显微镜进行观察。当除去氨甲喋呤,转运中间体
消失,因为DHFR能够解折叠,从而进入线粒体基质。
4. 请设计一个实验证明ATPase既能催化ATP的水解,又能催化ATP的合成（答案）
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答: 可采用来自其它膜结构中的ATPase作实验, 如用质膜中的Na+/K+ ATPase。在细胞质膜中,该酶的功能是水解ATP进行K+的逆浓度梯度运输,这是该酶在细胞质膜中的惟一功
能。
实验采用红细胞。首先分离红细胞并在高K+离子水溶液中制成血影,使其内部具有极高K+离子浓度，然后将之放入具有极高浓度的Na+离子环境中,“细胞”内的K+向外移动,而Na+向细胞内移动。这两种离子都是沿各自的浓度梯度向下移动,而不像在生活细胞中那样逆浓度梯度移动。如果在红细胞血影中加入ADP和Pi的话,离子的移动会引起ATP的合成而非ATP的水解(图7E-3)。
图7E-3利用红细胞血影和Na+/K+ ATPase重组小泡进行的ATP合成实验
图中小写字母表示离子移动的方向。
上述实验结果表明,在科学研究中，不能总是按常规思维去认识事物，反向理论也有很重要的作用。上述结果是根据酶催化反应的反向理论去认识酶的作用后发现的,同时,该实验也证明了离子梯度能够驱使ADP磷酸化合成ATP。可以用这一结果预测在线粒体膜间隙中由电子传递所建立的质子移动力可用于ATP的合成。实验中合成ATP必须满足三个条件:要有膜结合的ATP合酶、离子梯度、合成ATP的化学材料(ADP和Pi),这三个条件在线粒体内膜的两侧都是具备的。
5. 请推测线粒体膜重建实验是如何进行的?（答案）
答: 为了证明F1具有ATP合酶的作用, 最好、最直接的方法是通过线粒体膜的重建实验,验证其功能, 即将线粒体内膜与其嵴上的F1颗粒分离出来,重新装配后研究F1的功能。
实验中先分离附着有F1颗粒的线粒体内膜小泡,然后将小泡置于加有NADH、ADP和无机磷的溶液中,这些小泡能够将NADH的电子经由小泡膜中呼吸链逐步传递给O2,偶联合成了ATP。
Efraim Racker实验室第一个成功进行了含有F1颗粒的线粒体内膜小泡的拆装。首先分离完整的线粒体，然后用超声波处理使线粒体破裂。破裂的线粒体内膜能够自我封闭成内膜小泡,其上结合有F1颗粒，然后用脲处理或用玻珠与内膜小泡一起振荡，使内膜上附着的F1颗粒脱落，形成没有颗粒附着的内膜小泡，将处理的样品离心后,分别收集沉淀和上清液。在显微镜下检查收集的沉淀都是表面光滑的小泡。经功能实验，这种光滑型的内膜小泡只有电子传递的功能而没有合成ATP的能力。实验收集的上清液中含有从内膜脱落的F1颗粒,经检查,这种颗粒既不能传递电子又不能合成ATP。非但如此,分离的F1颗粒能够水解ATP,其功能与结合在线粒体内膜时相反。根据这一结果推测,F1的正常功能是附着在线粒体内膜上进行ATP的合成,若是脱离了内膜则具有水解ATP的作用,因为失去了合成ATP所需要的能量。
这种假说得到实验的支持。将分离的F1颗粒与光滑的线粒体内膜小泡结合,使F1颗粒重新附着到线粒体内膜上,这种重建的含有F1颗粒的线粒体小泡不仅能够进行电子传递,而且具有ATP合成的能力(图7E-4)。通过线粒体内膜重建实验,人们得出结论∶线粒体内膜中的F1颗粒是一种ATP合酶，它是呼吸链上氧化(放能)和磷酸化(贮能)的偶联装置。