loadingmTOR信号通路与肿瘤的研究进展
摘要】 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长、增殖、分化、细胞周期调控等多个方面起到重要作用。近年来发现mTOR相关的信号通路复杂且涉及面广泛，其中多个元素的调控异常都与肿瘤的发生密切相关。mTOR抑制剂能够抑制由于该信号通路异常引起的癌基因的转化、肿瘤的生长和肿瘤血管生成。到目前为止，4种mTOR抑制剂被有效地应用于临床，有的已进入Ⅱ、Ⅲ期临床试
验。因此，对mTOR信号通路的深入研究对肿瘤的靶向性治疗具有重要意义。 【关键词】 mTOR信号通路；雷帕霉素；mTOR抑制剂；肿瘤治疗
ChinaABSTRACT: Mammalian target of rapamycin (mTOR) is a serine/threonine protein kinase that is centrally involved in the control of cell growth, proliferation, differentiation and cell cycle regulation. Recent studies have found that the mTOR pathway is complicated and the dysregulation of mTOR pathway is recognized to be associated with lots of tumors. Several inhibitors of mTOR could inhibit oncogene transformation, growth and angiogenesis of tumors. So far, four inhibitors of mTOR have been tested in clinical trials, and some have been accessed to phase Ⅱ or Ⅲ trial. Therefore, in this review, we discuss the regulators that govern mTOR pathway activity, and highlight clinical results obtained with the first generation of mTOR inhibitors to reach the oncology clinics.
KEY WORDS: mTOR signaling pathway; rapamycin; mTOR inhibitor; tumor therapy
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，从酵母到哺乳动物其广泛存在，且进化十分保守。mTOR是1991年HEITMAN等在分析不同啤酒酵母突变体对雷帕霉素抵抗作用的差别时发现的[1]。mTOR属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase, PIKK)蛋白家族，在调节细胞生长、增殖、调控细胞周期等多个方面起到重要作用。目前发现mTOR信号通路的过度活化与肿瘤的发生、发展密切相关，是肿瘤治疗的一个重要靶点。因此本文就mTOR信号通路与肿瘤的关系及治疗作一综述。 1 mTOR的结构 1.1 mTOR的分子结构
人的mTOR基因位于1p36.2上，其mRNA翻译后的蛋白质有2549个氨基酸残基，其分子结构复杂，分子质量为289ku。mTOR的结构域从氨基端到羧基端依次为HEAT重复序列(即Huntignton、EF3、PP2A一个亚基、TOR1)、FAT结构域、FRB激酶结构域、NRD及FATC结构域(图1)。mTOR的N端有20个重复的HEAT序列，每个HEAT大约由40个氨基酸残基组成2个α螺旋，每个α螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。这些重复的HEAT模体介导了蛋白质间的相互作用[2]。靠近mTOR的C端有一个激酶结构域，约234个氨基酸残基，其结构和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的催化域相似，是mTOR属于PI3K蛋白激酶类家族的重要原因之一。紧挨着激酶结构域上游的是FRB(FKBP12-rapamycin binding)结构域，它是FKBP12-rapamycin复合物的结合位点，在雷帕霉素特异性抑制mTOR中起着连接作用：
雷帕霉素可与细胞内的受体FKBP12结合形成FKBP-rapamycin复合物，再与mTOR的FRB区相结合，从而抑制mTOR的激酶活性[3]。FRB激酶结构域的上游是一个相对较大的FAT(focal adhesion targeting domain)结构域，约568个氨基酸残基，同样在mTOR的C端最后也有一个FAT结构域，即FATC(focal adhesion targeting domain of C-ternimal)结构域。它们在空间上形成特殊的构象以暴露出mTOR的激酶结构域区。FATC结构域在mTOR活性稳定上起着关键的作用，研究表明该结构域内一个氨基酸的缺失都能使mTOR活性丧失[4]。NRD(negative regulatory domain)结构域位于激酶催化域和FATC结构域中间，是mTOR负性调节域。
1.2 mTOR的存在形式
mTOR在生物体以两种复合物的形式存在，即mTORC1及mTORC2。mTORC1包括mTOR、mLST8(mammalian ortholog of LST8，又名GβL)和raptor (regulatory-associated protein of mTOR)；mTORC2包括mTOR、mLST8、mSIN1 (mitogen-activated protein kinase-associated protein 1)及rictor (rapamycin insensitive companion of mTOR)。研究表明，雷帕霉素主要通过与细胞内受体FKBP12结合而抑制mTORC1，但是对mTORC2无作用。目前研究较多的是mTORC1复合物。raptor分子结构相对保守，分子质量为150ku，所有raptor家族成员都在N-端有一段保守区及3个HEAT重复序列，mTOR分子N-端的重复序列使得它与raptor结合紧密，而C-端与raptor结合较疏松[5]。如图2所示，raptor是一种桥梁分子，它可以将mTOR与下游的靶分子如P70S6K、4EBP1连接起来。但是，在营养素等上游因子不存在时，mLST8将mTOR、raptor紧密地锁在一起，使得mTOR不能与其下游的靶基因结合；当营养素存在情况下，这一复合物发生空间构象改变，使得mLST8和raptor之间的结合断裂，暴露出mTOR，从而使其下游靶基因结合于raptor上[6]。对mTORC2复合物研究不多，目前认为它可以通过磷酸化蛋白激酶C-α(PKC-α)通路来调节肌动蛋白细胞骨架[7]。 2 mTOR信号传导途径 2.1 mTOR的上游信号传导途径
mTOR可对细胞外包括生长因子、胰岛素、营养素、氨基酸、葡萄糖等多种刺激产生应答。它主要通过PI3K/Akt/mTOR途径来实现对细胞生长、细胞周期等多种生理功能的调控作用。
2.1.1 经典信号传导途径——PI3K/Akt/mTOR信号通路
PI3K可被激活的Ras通路以及一些生长因子及细胞因子激活，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、血小板源性生长因子、集落刺激因子等[8]。如图3所示，这些细胞外生长因子配体与跨膜的酪氨酸激酶受体如胰岛素受体(IR)结合后，IR的多个酪氨酸残基被磷酸化而激活；活化的IR通过磷酸化其底物蛋白来招募PI3K的p85亚基，并把信号传递给p110亚基，导致PI3K的激活；活化的PI3K催化PI-4-P与PI-4，5-P2的3位磷酸化而生成PI-3，4-P2与PI-3，4，5-P3后，后两者仍然在细胞膜上，召集下游分子Akt到细胞膜上。PI-3，4，5-P3可以激活磷脂酰肌醇依赖性激酶-1(PDK-1)，从而使Akt
的308位的Thr磷酸化，在PDK-2的存在下，其473位的Ser再被磷酸化从而使Akt完全被激活。
正常情况下，结节性脑硬化复合物-1(TSC-1)和TSC-2形成二聚体复合物，是小GTP酶Rheb(Ras-homolog enriched in brain)的抑制剂，而Rheb是mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此TSC-1/TSC-2在正常情况下抑制mTOR的功能。当Akt活化后，它可磷酸化TSC-2的Ser939和Thr1462，抑制了TSC-1/TSC-2复合物的形成，从而解除了对Rheb的抑制作用，使得mTOR被激活[9]。
在整个PI3K/Akt/mTOR信号通路中，有一条十分重要的负反馈调节剂就是10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on
chromosome 10, PTEN)。PTEN是一个肿瘤抑制基因，位于人染色体10q23。它有一个蛋白酪氨酸磷酸酶结构域，在这条通路中可以将PI-3，4-P2与PI-3，4，5-P3去磷酸化，从而负调节PI3K下游AKt/mTOR信号通路的活性[10]。 2.1.2 非依赖PI3K/Akt途径
越来越多的研究发现AMPK(AMP-activated protein kinase A)与mTOR的活性调节有关。有研究表明在哺乳动物细胞系中，氨基酸的代谢调节不是通过PI3K/Akt/mTOR通路来实现的，而是直接通过LKB1/AMPK/mTOR通路来调节。在细胞中，当ATP/ADP比率下降时，AMP的水平变化比ATP的变化更为敏感。AMPK的活性则对于细胞内AMP水平非常细微的变化都能很快察觉到[11]。在缺乏能量的细胞内，AMPK可以直接磷酸化并提高TSC-2的活性，促进TSC-1/TSC-2复合物形成，抑制Rheb酶活性，从而间接抑制mTORC1通路的活性[12]。AMPK在能量压力下还可以直接磷酸化mTORC1[13]。 2.2 mTOR的下游信号传导途径
活化的mTOR通过磷酸化蛋白翻译过程中的某些因子来参与多项细胞功能，其中最主要的是4EBP1和P70S6K。
4EBP1：4EBP1(eIF4E-binding protein1)的mRNA中含有从DNA中转录得到的遗传信息，是蛋白质生物合成的模板。在真核生物蛋白质合成的起始阶段，由于5′端mRNA的特殊帽状结构，核糖体不能直接与mRNA相结合，而是需要翻译起始因子的帮助。eIF-4E又称为帽结合蛋白(cap-binding protein, CBP)，它与mRNA的5′帽结构结合后再与eIF-4G结合，eIF-4G作为一种支架蛋白募集eIF-4A形成三聚体复合物eIF-4F，而此复合物可以使核糖体结合到mRNA上从而起始蛋白质的翻译。4EBP1有同eIF-4G相似的eIF-4E识别序列，故4EBP1、eIF-4G与eIF-4E的结合存在部分重叠，4EBP1可以通过竞争性抑制eIF-4G与eIF-4E的结合来达到抑制翻译起始的作用。mTOR信号通路通过磷酸化4EBP1，使eIF-4E与其解离并活化，促使翻译起始复合物的形成，从而加速蛋白质的合成(图4)。4EBP1与eIF-4E的解离，在活化一些位于5′-UTR(5′-untranslated terminal region)区特殊的调控元件起着重要的作用，如c-myc, cyclin D1以及鸟氨酸脱羧酶。相反，当生长因子或营养素缺乏，或者有mTOR抑制物存在时，4EBP1去磷酸化，并与eIF-4E结合从而抑制翻译起始[14]。
3 mTOR信号通路与肿瘤的关系
近年来，很多关于雷帕霉素及其衍生物如CCI-779、RAD-001的作用研究，向我们展示了mTOR信号通路在肿瘤发生发展中起着重要的作用。与肿瘤密切相关的多项细胞功能如细胞增殖、细胞周期、蛋白合成、细胞迁移等均受控于mTOR的调节。现已发现许多肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌中都有mTOR信号通路的调节异常。 3.1 PI3K/Akt/mTOR通路的过度激活
PI3K/Akt/mTOR信号通路活化与多种肿瘤发生密切相关，它能够加速细胞周期、减少细胞凋亡、并促进肿瘤细胞的迁移，这在脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌中早已有报道[16-18]。活化的PI3K可激活下游的Akt，激活的Akt使肿瘤细胞对凋亡诱导耐受、细胞生长代谢异常增加。过度活化的Akt激活其下游的底物，包括糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)、6-磷酸果糖激酶-2、BAD蛋白、内皮型一氧化氮合酶、mTOR、遗传性乳腺癌与卵巢癌易感基因(hereditary breast and ovarian cancer susceptibility gene, BRCA1)，其中激活的靶蛋白mTOR可以引起肿瘤细胞的快速增殖、癌蛋白分泌增加、细胞周期加快、G1期时程缩短，利于肿瘤的迅速发生发展[19]。在这条信号通路中，如前所述，PI3K可以被Ras信号、或者直接被一些生长因子所激活；PI3K的催化亚基p110的异常扩增及突变亦出现在多种人类肿瘤中。Akt可被多条途径激活，尤其是PTEN基因的突变或缺失，这在前列腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤和黑色素瘤中发生率最高[20]。在1/3的上皮性肿瘤中发现了原癌基因Ras可激活Akt通路[21]；在很多肿瘤中发现了活化的受体酪氨酸激酶可以激活Akt，可能是通过异二聚体ErbB-2/ErbB-3激活PI3K途径来完成[22]。见表1。表1 肿瘤组织中PI3K/Akt/mTOR通路的过度激活（略）
3.2 PTEN功能的缺失
自从PTEN发现以来，至今已在多种肿瘤中发现存在着PTEN的改变。肿瘤细胞中PTEN改变的主要形式之一是突变，包括插入、丢失、替换、移码突变、RNA异常拼接和蛋白截短等，其最常见的突变发生于外显子3、5、8。PTEN的另一种改变形式是5′启动子区的CpG岛甲基化。在PI3K/Akt/mTOR信号通路中，PTEN的功能缺失使其对PI3K的抑制作用解除，从而激活了Akt/mTOR等下游信号通路。 3.2.1 PTEN的先天性遗传突变
PTEN在36%～66%的子宫内膜癌中有突变，这在肿瘤中是突变率最高的，同时伴随Akt的高磷酸化[33]。SOLIMAN等[34]人在99例进展期子宫内膜癌标本中分析PTEN、磷酸化的Akt(p-Akt)、Ki-67(细胞增殖的一种标记)的表达，发现66%的标本不表达或低表达PTEN，同时有40%的肿瘤高表达p-Akt。PTEN的低表达与p-Akt的高表达显著相关。另外，该研究发现PTEN(+)和p-Akt(-)的患者拥有更高的生存率。p-AKT(-)使得Ki-67的表达下调，且表达低水平Ki-67的患者预后相对较好，也许能部分解释该现象。有趣的是，在子宫内膜非典型增生里PTEN的突变率亦高达20%～30%。临床上使用口服黄体酮治疗子宫内膜非典型增生，但是只有30%～50%病例有效。在对黄体酮治疗无反应的患者中发现有升高的或持续的p-mTOR表达存在。另外，MUTTER等[35]研究发现，子宫内膜腺癌中PTEN突变率