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上脂皮质毛细血管、人脐静脉以及人皮肤和脂肪的毛细血管。
5. 神经元细胞的培养底物需要经过 胶原 或 聚L-赖氨酸 的特殊处理。
6. 神经生长因子、有丝分裂抑制剂（如阿糖胞苷、5-氟脱氧尿嘧啶） 可以防止非神经元细胞的生长，用于神经元细胞的纯化。
7. 肿瘤细胞培养过程中常用的促细胞生长因子有 胰岛素 、 氢化可的松 、 雌激素 。
8. 神经胶质细胞主要取材部位为 中枢神经系统的皮质组织。
9. 神经组织的体外培养主要包括 神经元 和 神经胶质细胞 的培养。
10. 永生性 也称不死性，即在体外培养中细胞表现为可无限传代而不凋亡。 11. 侵袭性 是肿瘤细胞的扩张性增殖行为，体外培养的癌细胞仍持有这种性状。 二、判断
1、上皮细胞培养中使用的各种液体包括细胞冻存液、分离液以及培养液都需要添加比其他组织培养浓度更高的抗生素。（ O ）
2、 神经元细胞培养需要极高的营养条件，一般以RPMI-1640与Ham F12混合培养基
（1：1，体积比）作为基础培养基。（ X ）
3、 人肿瘤细胞主要来自外科手术或活检瘤组织。（O ） 4、 制备肿瘤细胞时应尽量选用退变组织。（ X ） 5、 干细胞才是支持肿瘤生长的成分。( X )
6、 饲养层细胞培养法是目前表皮细胞体外培养的较为成熟的技术。（X ） 三、简答题
1、体外培养肿瘤细胞的生物学特性有哪些？ ①永生性 ②形态和性状 ③侵袭性 ④生长增长 ⑤细胞遗传 ⑥异质性
2、应用体外培养技术进行肿瘤研究具有的优点。
①可以免受机体内部因素的影响，从而便于研究理化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响 ②便于眼睛肿瘤细胞的结构和功能
③肿瘤细胞可长期保存以便于观察其遗传行为的改变 ④用于抗癌药物的快速筛选
3、常用的排除成纤维细胞的方法有哪些？简述其操作过程。 机械刮除法、反复贴臂法、消除排除法
机械刮除法：a.制备无菌刮头 b.标记 c.刮除 d.用Hanks液冲洗一两次，冲洗被刮掉的细胞 e.注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止
反复贴臂法：a.细胞生长达一定数量后，倒出原瓶内培养液，用以蛋白酶消化后，Hanks液冲洗2次，加入不含血清的培养液，反复吹打制成细胞悬液 b.取三个培养瓶，分别编号为A 、 B、C
先把悬液接种入A培养瓶中，然后置温箱中静止培养5~20min ，取出并轻轻倾斜培养瓶，让液体集中在培养瓶的一个角后，慢慢吸出全部培养液，，再转接到B培养液中；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养。
c.B 培养瓶中细胞培养5~20 min后，按A 瓶的处理方法，把培养液注入C培养瓶中置温箱中培养；再向B瓶中补加完全培养机制温箱中继续培养。
第七章 与动物细胞培养相关的部分实验技术
一、填空
1. 制备单克隆抗体的融合是指将免疫小鼠的（ 脾细胞 ）和（小鼠骨髓瘤细胞 ）融合。 2. 融合过程中使用的促溶剂主要是（ 聚乙二醇 ）。 3. 第一个单克隆抗体是（ 1975 ）年制备成功的。 4. 常用的细胞转染方法有（ 磷酸钙转染 ）、（ 脂质体转染）和（ DEAE-葡聚糖转染 ）。 5. 单克隆抗体的大量制备普遍采用的方法是（ 杂交瘤技术 ）。其他参考答案：小鼠腹腔
接种法
6. 杂交瘤细胞克隆化的方法很多，常用的包括（ 有限稀释法 ）和（ 软琼脂平板法 ）。 7. 在细胞融合过程中瘤细胞株应用最多的是（ 杂交瘤 ）细胞株。
8. 细胞融合培养时加入在（ HAT ）选择系统，目的是保证只有杂交瘤细胞生长。 二、名词解释
单克隆抗体：是由一种B细胞克隆所产生的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子。 细胞的基因转染：将外源性基因采用化学或物理的方法人工地导入细胞的技术，就叫做细胞
的基因转染，又叫基因转移、基因转导。
三、判断题
1.脂质体法比磷酸钙法转染的效率高。（ √ ） 2.促溶剂PEG的最适使用浓度为60%~80%。（ × ）
3.融合过程中PEG作用细胞的时间通常以1~2min为宜。（√ ） 4.在单抗制备过程中可以采用任何品系的动物进行免疫。（ × ） 四、简答题
1.HAT培养基筛选杂交瘤细胞的机理是什么？ 答：HAT培养基是含次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）及氨基蝶呤（A）的一种选择培养基，这三种成分均与细胞DNA合成有关。A可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲喋呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。这时正常细胞可以通过“补救途径”，由TK和HGPRT酶利用T和H合成核酸而繁殖。瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过补救合成途径合成DNA而繁殖。B细胞虽含有HGPRT，但在体外培养只存活5~7d。融合细胞（杂交瘤细胞）含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞能利用B细胞的HGPRT酶通过补救途径合成
— —
DNA而繁殖。因此在HAT培养基中，HGPRT或TK瘤细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有融合成功的杂交瘤存活。
2.骨髓瘤细胞和脾细胞融合过程中应特别注意的几个问题是什么？ 答：（1）细胞比例。骨髓瘤细胞与脾细胞的比例可从1：2到1:10不等，常用1:5到1:10之
间的比例。
（2）反应时间。各个步骤都需在规定的时间下严格操作。
（3）反应温度。整个融合过程都要在370C的水浴中进行，所需试剂要在370C预热。
（4）PEG的选择。相对分子质量为1000~6000的 PEG均可用，分子量越大，毒性越强，单分子量过小，又影响融合效果。
3.单克隆抗体和多克隆抗体有何区别？
答：如果用经免疫过的动物的脾细胞获得杂交瘤细胞，则得到单克隆抗体，如果用动物的血清，则得到多克隆抗体。单抗是有单个细胞起源的细胞克隆分泌的，所以只针对蛋白抗原的单一抗原决定簇，而多抗是有多个不同克隆的B细胞产生的，是多种细胞的混合物，但其中的每一种抗体也只是针对一种决定簇。多克隆抗体纯度较低、特异性较差、易引起交叉反应和过敏反应，且产量有限。单克隆抗体性质纯、效价高、特异性强，可以避免交叉反应，提高了抗原—抗体反应的敏感性和特异性。
第八章 植物细胞培养概论
一、 名词解释
外植体：在植物组织培养中由活体植物上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等，称为外植体。
愈伤组织：指在人工培养基上，由外植体的表面形成的一团不定形的排列疏松的薄壁细胞。 脱分化：指在植物组织细胞培养中，一个成熟细胞或已分化细胞转变为未分化状态的过程。 细胞全能性：每个细胞都携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株或个体的潜在能力。
二、 判断题
1. 愈伤组织是脱分化的植物组织细胞。（F）
2. 在植物组织培养和细胞培养中都包含愈伤组织培养。（T）
3. 植物细胞培养的主要目的是获得所需的细胞和各种所需的产物。（T）
三、 填空
1、 外植体经自来水冲洗后应进行（浸润灭菌、灭菌剂处理、无菌水刷洗）三步，完成灭菌过程。
2、 植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性 3、 1943年，（White）正式提出植物细胞全能性理论，认为每个植物细胞具有母株植物的全套遗传信息，具有发育成完整植株的能力。
4、 植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒，利用（茎尖分生）组织培养可脱去病毒，获得脱毒植株。
5、 用于外植体表面灭菌的灭菌剂主要有（次氯酸钙）、（过氧化氢）、（氧化汞）等。 四、 问答题
1、 植物细胞培养和植物组织培养的不同体现在哪些方面？
答： ① 培养对象不同：一般来说，以各种植物的器官和组织，如根、茎、叶、花、未熟的果实、种子、愈伤组织等为培养对象的培养技术属于植物组织培养；而以各种形式的植物细
胞，如脱分化的薄壁细胞（愈伤组织）、单细胞、单倍体细胞、原生质体、小细胞团、固定化细胞等为培养对象的培养技术属于植物细胞培养。愈伤组织培养既属于组织培养又属于细胞培养。
② 培养目的不同： 植物组织培养的主要目的是获得所需的植物组织和再生植株，还可以生产某些次级代谢物，在名贵花、木、瓜、果种苗（试管苗）的产业化生产、种苗的脱毒、植物的大规模快速繁殖等方面具有重要的意义和应用价值；而植物细胞培养的主要目的是获得所需的细胞和各种所需的产物，也可以利用植物细胞培养进行生物转化，将外源底物转化为所需的产物，还可以利用植物细胞培养进行种质保存、人工种子的制备和植株的大规模快速繁殖等。
2、 植物细胞培养在农业方面有哪些应用？ 答：① 在植物育种方面的应用：（1）单倍体育种：通过花药（花粉）培养获得单倍体植株，然后通过秋水仙素处理使其染色体加倍，可以迅速使后代基因型纯和，加速育种进程。 （2）胚培养：采用幼胚（或胚胎、胚珠等）离体培养使自然条件下早熟的幼胚发育成熟，获得杂种后代。 （3）体细胞杂交：体细胞杂交是打破物种间生殖隔离，实现其有益基因的交流，改良植物品种，以达到创造植物新类型的有效途径。 （4）细胞突变体的诱变与筛选：在培养过程中，培养物的细胞处于不断分裂的状态，易受培养条件和外界压力的影响而发生变异。 （5）遗传转化：可以获得抗逆，高产及优质的转基因植株，能解决植物育种中用常规杂交方法所不能解决的问题，并能与常规育种方法相结合，建立高效育种技术体系。
② 在植物脱毒方面的应用：许多植物，特别是无性繁殖植物均受到多种病毒的侵染，造成严重的品种退化，产量降低，品质变劣，利用茎尖分生组织培养可脱去病毒，获得脱毒植株。 ③ 在离体快繁方面的应用：传统的植物繁殖是在田间或在温室中进行有性繁殖或无性繁殖，效率低，时间长，不利于优良品种和新品种的大规模推广应用。由于植物离体繁殖快速，而且材料来源单一，遗传背景均一，不受季节和地区等的限制，重复性好，离体快繁比常规方法快数万倍至百万倍。
④ 在植物种质资源保存方面的应用：利用植物细胞继代培养或者冷冻保存的方法进行种质保存，不仅简单方便，而且可以使植物的遗传特性得以长期稳定地保存，对于稀有植物品种、优良植物品种和新型植物品种的种质保存具有重要的意义。同时，离体保存的材料不受各种病虫害侵染，而且不受季节的限制，所以利于种质资源的地区间及国际间的交换。
3、 外植体的清洗和灭菌如何操作？
答：可应用70%酒精和一定浓度的次氯酸钠溶液来灭菌外植体，其方法如下： ① 材料的选取与清洗
1）选择无菌斑和虫害的植株作为母株。
2）剪取所需叶片、茎段（2～3厘米）及根等材料，在自来水下冲洗掉泥土等杂物。 3）在加有洗洁精的水中清洗材料，并用自来水冲洗干净，分装如干净的三角烧瓶中，备用。 ② 灭菌（在超净工作台上操作）
1） 在装有材料的三角瓶中加入70%酒精至浸没材料， 1～2分钟（可根据材料经试验而定）后迅速倒掉酒精。
2）在装有材料的瓶中加入6%～20%的安替福明溶液5～30分钟（浓度和时间可根据材料经试验而定），在此过程中不断摇晃三角瓶并用火焰烧瓶口数次。 3）在无菌条件下，用无菌水将材料冲洗至少三次，即可。
第九章 植物细胞培养的条件