loadingHCl ,用蒸馏水清洗致近pH=5.5，保持过夜，如果pH值不低于5.0，抽滤除去HCl,用2 mol/L NaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH=6.5 0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。
（2）装柱：取直径1.6 cm，长度为30 cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，然后关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20 cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH=6.5, 0.02 mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1 cm左右。
（3）上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1 ml/min。
（4）洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0 mol/L NaCl的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。
（5）聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就被透析膜外的聚乙二醇所吸收，当浓缩到5 mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。 （6）透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。
3、溶菌酶活力测定
（1）酶液配制：准确称取溶菌酶样品5 mg, 用0.1 mol/L, pH=6.2磷酸缓冲液配成1 mg/ml的酶液，再将配制酶液稀释成50 μg/ml.
（2）底物配制：取干菌粉5 mg加上述缓冲液少许，在研钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25 ml，此时在比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。
（3） 活力测定：先将酶和底物分别放入25 OC恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4 mL放入比色杯中，在450 nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸取样品液0.2 mL（相当于10 μg酶），每隔30 s读1次吸光度，到90 s时共计下四个读数。
（5）活力单位的定义是：在25 ℃，pH=6.2，波长为450 nm时，每分引起吸光
度下降0.001为1个活力单位。
酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001 比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质
【实验结果】
体积
步骤项目 制备蛋清 溶菌酶分离 D152树脂柱层析 Sephadex G50层析
4、溶菌酶纯度鉴定与分子量测定 (1)蛋白样品的处理
取200 μL上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入200 μL 的2×上样缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在100 ℃沸水浴中加热3～5 min，取出后10000 r/min 离心10 min，取上清待用。 ① 电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。(试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。)
② 按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。（凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。） ③ 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶直至离边缘5 mm处，迅速插入样梳，静置。（样梳需要一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。）
④ 拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。（要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样的效果.）
⑤ 加样，从第一个开始按已编排好的顺序依次加入蛋白Marker和相应体积的样
(ml)
总蛋白量(mg)
总活力 单 位
比活力 (单位/mg)
回收率(%)
品。其中Marker和样品加样量均为20 μL。（微量移液器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。）
⑥ 电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在20 mA，当进入分离胶后改为30 mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。
⑦ 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，42 ℃染色40 min左右。（剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。）
⑧ 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。
⑨ 将凝胶扫描分析，求出溶菌酶的相对分子质量。
试剂 H2O 30%丙烯酰胺溶液 1.5 M Tris-HCl （pH=8.8） 1.5M Tris-HCl （pH=6.8） 10% SDS 10% AP TEMED
0.1 0.1 0.004 0.04 0.04 0.004 — 0.5 15%分离胶（10m L） 2.3 5.0 2.5 5%浓缩胶(4m L) 2.7 0.67 — 六、注意事项
1.等电点沉淀后利用离心的办法，要尽量除去沉淀； 2.调节pH时要避免局部过酸； 3.提取过程中尽量避免泡沫的产生
4．加样蛋白浓度低于20 mg/mL，上样的体积小于柱体积的1/3。 5. 在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。过大，会使填料压缩紧密，导致流速过低，层析柱有可能堵塞而实验失败，流速过小，实验时间过长，引起酶的活性变化。对于CM-Sepharose FF填料，在最合适流速在100cm/h以下。因此，在我们的实验中，控制流速为2 mL/min。
6．冲平过程一定不能省。因为在上样过程中，还有未挂柱的蛋白未能从色谱柱中完全流出，因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平，以便使未结合或结合不紧密的杂蛋白流出，以免干扰洗脱。
7．N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。
8．安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。 9．用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 10．加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。
11.实验试剂使用应当注意安全操作；做好防护及应急处理工作。
溶菌酶酶活力的测定方法 二 溶菌酶标准曲线的绘制
采用分光光度法：溶菌酶在 281nm 波长处有最大吸收峰，制备不同浓度的溶菌酶溶液，在 281nm 波长处测定吸光度，并绘制标准曲线，可求出标准曲线回归方程。 试剂配制