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微生物菌种选育与保藏 本章知识概要
第一节 菌种分离与筛选 第二节 菌种选育 第三节 菌种保藏
第一节 菌种分离与筛选 1、采样
原则：
材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。 可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。 土壤、水、空气、动植物体都含有微生物。
土壤由于具备了微生物所需要的营养、水分、空气。是微生物最集中的地方从土壤中几乎可以分离所需要任何菌株。
细菌（108）＞放线菌（107） ＞ 霉菌（106）＞酵母菌（105）＞ 藻类（104）＞原生动物（103） ②采样方法：
选择适当地点和场所、用无菌器皿取样十克，装入袋中，记录采样地点、时间、环境等等。 2、富集培养：
在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下，迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需要的菌株。 A：控制营养条件----纤维素酶产生菌
B：控制培养条件----施加压力、pH、温度、氧气、根据特殊生理特征、 C：添加特殊抑制剂---抗生素 3、纯种分离：
富集培养而得到微生物，并不能达到纯化标准，杂菌并没有死亡、还需要进一步纯化----纯培养
粗放型：菌落纯 精细型：菌种纯
划线分离法 A：粗放型 涂布分离法
稀释分离法 平板划线分离法：
接种针挑取含有微生物样品，在固体培养基表面上划线，适当条件培养后，挑取单菌落。 稀释分离法
用1ml无菌吸管精确地吸取1ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中……其余依次类推。 涂布分离法
用涂棒蘸取培养液，在固体培养基表面均匀涂平，获得单菌落。 精细型：
毛细管分离法：利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。
流式细胞仪：流式细胞仪（Flow CytoMeter, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点 ，成为当代最先进的细胞定量分析和检测、筛选技术。 筛选方案：
4、性能鉴定：
平皿快速检测 生产性能测定 平皿快速检测法
第二节 优良菌种选育 自然选育 诱变育种
一、自然选育
1、自然选育：菌种在生产过程中不经过人工处理，利用微生物自身碱基突变而进行的菌种筛选过程。
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①多因素低剂量的诱变效应：辐射、H2O2、O2
②互变异构：DNA分子的碱基，存在酮式-烯醇式或氨式-亚胺式互变异构。不同的互变异构体形成氢键的方向和能力不同，有可能导致复制时出现错误。例如在正常情况下，A（氨式结构）与T（酮式结构）配对；当A以亚胺式存在时（几率非常小），则与C配对。 2、诱变育种
利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，使菌体负责遗传作用的DNA分子中的碱基对产生突变，进而采用简便、快速和高效的筛选方法，获得所需要的高产优质菌种的方法。 诱变育种原理：基因突变
染色体畸变：染色体或DNA片段发生缺失、易位、 重复等现象 基因突变：DNA碱基发生变化
诱变剂：物理、化学、生物三大类。 （1）物理诱变剂
紫外线、X-射线、γ-射线、激光、快中子、超声波、同位素等等
紫外线诱变机制：造成DNA链断裂或是DNA分子内或分子间发生交联。核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长处。 （2）化学诱变剂
化学诱变剂的种类有许多，但具有高效诱变作用的并不多，常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种类型。
①与核酸碱基化学反应的诱变剂
此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。
A：烷化剂，带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。
它们的诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。
常见的烷化剂有硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。
B：亚硝酸----亚硝酸的作用主要是使碱基氧化脱氨基，如使腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)分别脱氨基成为次黄嘌呤(H)、尿嘧啶(U)和黄嘌呤(X)。复制时，次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)配对。 （2）、 诱变育种的方法步骤 2.1 制定筛选目标 ①高产量
②生长速度快、产孢子多； ③消除某些色素或无益组分； ④能有效利用廉价的发酵原材料；
⑤改善发酵工艺中的某些缺陷(如泡沫过多、对温度波动敏感、菌丝太多、自溶早、过滤困难等)。
2.2 制定育种方案
诱变筛选的典型流程见后图，除了增加了诱变处理，其他与前面所讲的自然选育过程基本相似。
菌株选育典型流程
出发菌株（砂土管或冷冻管） 小试 原种特性考擦
斜面 或摇瓶培养24h 培养基优化 单孢子悬液 菌悬液 挑出高产菌株
诱变处理 摇瓶复筛
处理前后计数
稀释涂平板 传种斜面 观察单菌落形态
挑选单菌落转种斜面 保藏菌株 对照组比较
摇瓶初筛 挑出高产斜面 ①出发菌株的选择
用来进行诱变实验的菌株就是出发菌株，对它的选择是诱变育种工作成败的关键，挑选出发菌株有以下几点原则：
a. 来源于自然界直接分离的野生菌株.
b. 有利于发酵产物合成的性状，出发菌株应具有生产上所需要的代谢特征。
c. 要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。
d.生产或科研上经过多次诱变改造的菌株。 ③诱变剂的选择
诱变剂复合处理及其协同效应 ④突变株筛选
诱变处理后遗传性能发生变化：营养缺陷型、抗性、代谢、呼吸缺陷、形态变异、生长繁
殖、温度敏感性突变株。 ⅰ粗筛方法：
A：菌体形态观察法：形态与产量并没有完全相关性，形态特征变化可能引起产量变化，阿舒假囊酵母-VB2高产菌落深黄色，浅黄色、白色低产。
B：平皿快速检测法 a：纸片显色法，浸有指示剂滤纸。 b：变色圈法；c：透明圈法；d：生长圈法；e：抑制圈法。 ⅱ复筛摇瓶培养法：
a、 抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选 常用的筛选方法为：
1）抗末端产物结构类似物突变株。
2）利用营养缺陷型回复突变筛选抗反馈突变株。
例如：谷氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。
b、抗性突变株的筛选
这包括抗生素、金属离子、温度、噬菌体等抗性突变株的筛选。方法是在平板中（分离培养基）和初筛培养基中加入不同的抗性物质，能够很好生长的菌株就为抗性突变株。 选择能和抗生素或合成中间体结合的对菌体生长有毒性作用的抑制剂,如二价金属离子加入培养基中，当抑制剂达到一定浓度时，抗生素低产菌株不能够生存，可以得到高产菌株。
c、组成型突变株的筛选
(1)通过加入诱导酶合成抑制物筛选组成酶的突变株。如邻硝基-β-D-岩藻糖苷抑制 β-半乳糖苷酶的合成。
(2)利用交替培养法使组成型突变株处于优势。 (3)显色法筛选组成型突变株生产酶。
如邻硝基苯半乳糖苷用于筛选β-半乳糖苷酶组成型突变株，刚果红用于筛选纤维素酶组成型突变株。
d、营养缺陷型的选育*
营养缺陷型是指通过诱变育种，出发菌株发生基因突变，致使细胞组成成分的合成途径出现某些缺陷，在只含有最低限度营养物质的基本培养基上不能生长，必须在此中培养基中加入某些有机营养物才能正常生长。 氨基酸、维生素和碱基
与营养缺陷型对应的是野生型。
能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM minimal medium)；
在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基补充培养基(SM supplemental medium)； 可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基完全培养基(CM complete medium)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。 营养缺陷型的用途：
营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。 筛选营养缺陷型的步骤 菌种诱变 淘汰野生型