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课题 教学目标 和要求 教学重点 和难点 第五讲薄层色谱的应用 课时 4学时 1了解薄层色谱的等级划分、活化方法 2掌握薄层色谱的使用操作、定性分析原理、比移值的测定与计算 3 了解薄层色谱应用的领域 薄层色谱的操作使用、定性方法、展开剂的选择、比移值的测定 难点：多元展开剂的选择 内容 1.薄层板的活化 把涂好的薄层板置于室温晾干，放在烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105～110℃活化30min。氧化铝板在200℃烘4h可得活性Ⅱ级的薄层板，150～160℃烘4h可得Ⅲ～Ⅳ级薄层板。薄层板活性和含水量有关，活性随含水量增加而下降。 2.薄层板活性测定： ①硅胶板活性测定：取对二甲氨基偶氮苯、靛酚蓝和苏丹红三种染料各10mg，溶于1mL氯仿中，将此混合液点于薄层上，用正己烷-乙酸乙酯体积授课内容与教学过程设计 比9:1展开。若能将三种染料分开，并且按比移值对二甲氨基偶氮苯＞靛酚蓝＞苏丹红，则与Ⅱ级氧化铝活性相当。 ②氧化铝板活性测定：将偶氮苯30mg，对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红和对氨基偶氮苯各20mg，溶于50mL无水四氯化碳中，取0.02mL此溶液滴加于氧化铝板上，用无水四氯化碳展开，测定各染料的位置，算出比移值，根据下表各染料的比移值确定其活性。 表氧化铝活性与各偶氮染料比移值关系 活性级别 偶氮染料 偶氮苯 对甲氧基偶氮苯 苏丹黄 苏丹红 对氨基偶氮苯 勃劳克曼活性级的Rf值 Ⅱ 0.59 0.16 0.01 0.00 0.00 Ⅲ 0.74 0.49 0.25 0.10 0.03 Ⅳ 0.85 0.69 0.57 0.33 0.08 Ⅴ 0.95 0.89 0.78 0.56 0.19 1
3.薄层色谱使用操作 1)点样 通常将样品溶于低沸点溶剂（丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚、四氯化碳等）配成1%的溶液，用内径小于1mm的管口平整的毛细管点样。点样前，先用铅笔在薄层板上距离一段1cm处轻轻划一条横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径不超过2mm，如溶液太稀，一次点样不够可重复几次，但每次点样时需溶剂挥发后方可重点，防止斑点过大，造成拖尾、扩散现象。如在同一块板上点几个样，样点间距应在1～1.5cm，并且不要太靠近边缘。点样结束，样点干燥后，方可展开。点样要轻，不可刺破薄层板。 2)展开 待样品点干燥后即可放在展开剂中进行展开。薄层的展开需要在密闭容器中进行，先将选择好的展开剂放在容器中，使容器中空气饱和5～10min，再将点样好的薄层板放入容器中进行展开。点样位置要求必须在展开剂液面以上，当展开剂上升到薄层板前言距离顶端约1cm处或各组分已经明显分开时，取出薄层板放平、晾干，用铅笔画出前沿位置后进行显色，根据比移值鉴定各组分。 展开时展开剂的选择与柱色谱一样，主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑，凡溶剂的极性越大，则对一化合物的洗脱力也越大，即比移值也越大。薄层色谱的展开剂绝大多数使用有机溶剂，极性可参看柱色谱部分。一般薄层色谱的展开多采用极性大和极性小的展开剂配成混合展开剂，实际试验时可根据情况调节极性比例。如若样品各组分比移值都较小，可增大极性溶剂比例，以增加展开剂极性，反之，换用小极性展开剂。 图薄层层析装置 2
3)显色 薄层展开完毕后，取出薄层板，画出溶剂前沿，如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，需要经过显色法显色后才能观察到斑点位置，判断分离情况。常用显色法包括碘蒸气显色法、紫外灯显色法和显色剂显色法。现简要介绍如下： 碘蒸气显色法：碘能与很多有机化合物可逆的结合成有颜色的络合物，先将几粒碘结晶放在密闭容器中，碘蒸气很快充满容器，然后将展开完毕挥干溶剂的薄层板放入容器中，有机化合物即与碘作用呈现棕色斑点。立即将薄层板取出，标记斑点形状和位置，计算比移值。 紫外光显色法：如果被分离样品本身是荧光物质，可在暗处在紫外灯照射下观察到荧光物质的亮点。如果样品本身不具荧光，可在制板时，在吸附剂中加入适量的荧光试剂或在制好的板上喷荧光剂，制成荧光薄层板，在点样、展开后，放在紫外灯下观察，标记好斑点形状和位置，计算比移值。 显色剂显色法：根据被分离物质性质，采用不同显色试剂进行喷雾显色，即配制一定浓度的显色剂，将其喷洒在展开后的薄层板上，然后烘干、显色，画出斑点形状和位置，计算比移值。常用显色剂及被检出物质如下。 4.薄层色谱定性分析（比移值计算） 在薄层色谱的分析中，经常使用比移值表示物质移动的相对距离。通过比移值判断分离情况。 R??=溶质移动的距离a溶剂移动的距离L= 图薄层色谱展开图 3
5.薄层色谱应用试验 1）菠菜色素的提取 称取20g洗净后用滤纸吸干的新鲜菠菜叶，用剪刀剪碎并与20mL甲醇拌匀，研钵中研磨约5min，然后布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤液。 将菠菜汁放回研钵中，每次用20mL3:2体积比的石油醚——甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤。合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用10mL水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。弃去水——甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后虑入圆底烧瓶，水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL为止。 2）薄层层析 取四块硅胶G制备的薄层色谱板，110℃活化1h。 展开剂：a 石油醚——丙酮=8:2（体积比） b石油醚——乙酸乙酯=6:4（体积比） 活化的薄层板点样后，小心放入预先加好展开剂的广口瓶内，带展开剂上升至规定高度时，取出层析板，空气中晾干，铅笔作出标记。 分别用展开剂a和b展开，比较不同展开剂体系的展开效果。观察斑点在板上的位置并排出胡罗卜素、叶绿素和叶黄素的比移值的大小次序。特别注意，更换展开剂时，须干燥层析瓶，不允许前一种展开剂带入后一系统。 3）计算比移值、比较实验结果 计算几种色素的比移值 比较不同展开剂系统对色素分离效果 另：教师可根据教学实际情况，选择其他化学试剂进行薄层色谱分离实验，有较好分离效果即可，如亚甲基蓝、甲基橙等指示剂的混合物或者自制的黄连素、咖啡因、苯佐卡因等药物分子；也可布置为实验任务，让学生自行实验操作，寻找合适的展开剂系统或者鉴定化合物的纯度等作为练习或考核。 完成实验报告、预习柱色谱实验 课后作业 课后总结 4