loading以确认切下的片断是否为自己想要的片断。
（6）酶切后的质粒可以回收备用（见实验六：从琼脂糖凝胶中回收DNA片断）。 （7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。 7．思考
（1）酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？ （2）如何估计DNA用量和酶的用量？
（3）在吸取内切酶的时候如何操作才能别免浪费？
第二部分 目的基因的获得和重组载体的构建
实验四 PCR扩增制备目的基因
1．目的
学会PCR操作的基本技术。 2．原理
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐
热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。 3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。 4．试剂
3U/μl Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌dd water。 5．实验准备
dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000?溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），
10?加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。
合成的引物：Sense primer 5'-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3' BamHI
Antisense primer 5'-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3' EcoRI
目的基因模板质粒（遗传研究室惠赠）：已经克隆在pMD18-T载体上的1181bp纳豆激酶
（nattokinase，NK）基因。
待扩增的NK片段长度：837bp（825bp NK+5’BamH I位点GGATCC，3’EcoRI位点
GAATTC）。
6．操作步骤
（1） 在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最
终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
dd water 32μl 10×PCR buffer（不含MgCl2） 5μl 25mM MgCl2 3μl
2.5mmol/L dNTP 4μl（每种dNTP终浓度0.2mM） 10μmol/L Primer1 2μl（12.5—25pmoles） 10μmol/L primer2 2μl（12.5—25pmoles） 模板质粒 1μl（1×10-3pmoles） 3U/μl Taq酶 1μl（3u） 总体积 50μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序： ① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 60℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto② 29 times ⑥ 72℃ 10min
（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。 （4）清理桌面，撰写实验报告。
（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。 7．思考
（1）复性温度如何确定？ （2）为什么要在最后延伸10min？
（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？
实验五 目的基因片段与载体连接
1．目的
学会DNA片断的体外连接技术。 2．原理
在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同
粘性末端联接成重组DNA分子。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。 4．试剂
pUCm-T 载体，pET-his酶切载体，NK插入片断，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 5．实验准备
1.5ml离心管装入饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基（含
Amp）。 6．操作步骤
1）PCR产物与pUCm-T载体直接连接：
（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14～16?C。 （2） 取一个灭菌的1.5ml微量离心管，加入：
4?l PCR 产物混合液 1?l pUCm-T载体
0.5?l T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 1?l 连接酶缓冲液 3.5 ?l dd Water
总量 10?l 体系
（3） 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14?C水中保温过夜。 （4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4?C冰箱备用。
2）DNA回收片断（NK）与载体（pET-his）连接： （1） 取一个灭菌的1.5ml微量离心管，加入
4?l 回收DNA片断 1?l 酶切后回收的载体
0.5?l T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 1?l 连接酶缓冲液 3.5 ?l dd Water
总量 10?l 体系
（2） 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14?C干式恒温仪（或14?C水中）
中保温过夜。
（3） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4?C冰箱备用。 7．思考
（1）连接酶的最适温度室多少？ （2）为什么要采用14?C下连接？
（3）如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？
实验六 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断
1．目的
学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片断的基本技术。 2．原理
限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝
胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片断。 3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。 4．试剂
电泳缓冲液，溴化乙锭溶液，电泳级琼脂糖粉，10?加样缓冲液，DNA分子量标准，DNA凝胶回收试剂盒。 5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（10?储存液），1000?溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10?加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）； 6．操作步骤
（1）用1?TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。
（2）在胶上选定两个加样孔，分别加入少量（10μl）和大量（50μl ）DNA酶切产物，电泳。 （3）电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），
EB染色，在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意：含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用EB染色，也不用紫外灯照射！ （4）将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大
胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过得干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。 （5）按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA酶切产物： 1）Sangon UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作步骤：
（1）按400?l/100mg凝胶的比例加入Binging Buffer II，置于50-60℃水浴中10min，每
2min混匀一次，使胶彻底熔化。
（2）将熔化的胶溶液移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min。