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抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：吴春风, 马忠森, 王秀丽, 杨俊玲, 杨洋, 张越, 图们乌力吉, 乔俊华
【摘要】 目的: 制备抗人DcR3单克隆抗体（mAb）, 并鉴定其特异性。方法: 纯化的HisDcR3融合蛋白免疫小鼠, 应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化, 纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、 Ig亚型和效价。结果: 获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞, 均属IgG1亚型, 其腹水抗体效价为1×10-5～1×10-7, Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白, 其中1株（1B1）可与SW480细胞成分反应。结论: 成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株, 其分泌的抗体特异性强、 效价高, 为研究DcR3在组织中的表达、 分布及研制ELISA试剂盒奠定基础。 【关键词】 DcR3 单克隆抗体 制备
[Abstract] AIM: To prepare monoclonal antibodies(mAbs) against human DcR3 and identify their characterization. METHODS:
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BALB/c mice were immunized with purified HisDcR3 protein, and mAbs against DcR3 which prepared by hybridoma technique were purified and identified by their specificity, subtype, titers via ELISA and Western blot. RESULTS: Five hybridoma cell lines secreting mAbs against human DcR3 were obtained, which were determined as IgG1 subtype and ascites titers of five mAbs against DcR3 reached 1×10-5-1×10-7. Five mAbs were proved to recognize HisDcR3 protein specifically, one of which (1B1) could recognize SW480 cell. CONCLUSION: mAbs against DcR3 with high titers and specificity have been prepared and purified successfully, which laid a foundation for the study of DcR3 expression, distribution in tissu and development of ELISA kit.
[Keywords]DcR3; monoclonal antibody; preparation 诱骗受体3(decoy receptor 3, DcR3, 又称TR6)为近年新发现的一种可溶性肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员, 可竞争性结合肿瘤坏死因子(TNF)成员LIGHT、 FasL及TL1A[1, 2], 但并不介导细胞凋亡, 在细胞的生长、 分化、 死亡以及免疫调节等方面发挥重要作用, 与肿瘤、 自身免疫疾病、 移植排斥等密切相关。应用DcR3抗体研究DcR3在上述病变组织或细胞中的表达现已成为研究热点。目前, 国外已有商品化的抗人DcR3 mAb, 但价格昂贵, 国内尚无这方面的研究报道。我们运用淋巴细胞杂交瘤技术制备了抗人DcR3 mAb, 并进行了鉴定, 为研究DcR3在组织中的表达、 分布及研制
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ELISA试剂盒奠定基础。 1 材料和方法
1.1 材料 纯化的HisDcR3融合蛋白为本室自制[3]; RPMI1640购自Hyclone公司; PEG4000购自Merck公司; HAT、 HT购自Sigma公司; HRP标记的羊抗鼠及羊抗兔IgG抗体购自Santa Cruze公司; 抗体亚类测定试剂盒购自Serotech公司; Protein A亲和层析胶购自Pierce公司; PVDF膜购自Amresco公司; ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司。Sp2/0细胞株取自东北师范大学细胞遗传所; 高表达DcR3的人结肠癌SW480细胞株由本室保存; BALB/c小鼠(6～8周龄, 雌性, 清洁级)购自吉林省生物制品所。 1.2 方法
1.2.1 动物免疫 纯化的HisDcR3融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 初次免疫取100 μL (约50 μg)抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化, 腹腔注射, 第14天取100 μL(约50 μg)加等量弗氏不完全佐剂加强免疫, 以后每隔2周等量抗原不加佐剂腹腔免疫2次, 测定小鼠血清抗体效价达1∶106以上时准备融合, 融合前3 d取效价最高的小鼠腹腔注射抗原100 μg。
1.2.2 杂交瘤细胞株的建立及mAb的制备 (1)细胞融合: 无菌条件下, 取对数生长的Sp2/0细胞, 1000 r/min离心8 min, 弃上清, 用RPMI1640不完全培养液混悬细胞后计数, 取所需的细胞数。制备免疫小鼠脾细胞悬液, 将Sp2/0细胞与脾细胞按1∶5的比例混合, 37℃水浴500 mL/L PEG4000作用下进行融合, 融合后1000 r/min
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离心8 min, 弃上清, 用含有饲养细胞的HAT选择培养液轻轻混悬, 接种在96孔细胞培养板中, 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养。第10天换HT选择培养液, 第14天换含200 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培养液。(2)筛选及克隆化: 2～3周后当杂交瘤细胞长至孔底面积1/10以上时, 分别包被HisDcR3融合蛋白与His蛋白, 同时设立阴、 阳性及空白对照, 应用间接ELISA方法检测培养上清液。以P/N≥2.1为阳性, 选取与HisDcR3融合蛋白反应阳性而与His蛋白反应阴性孔的细胞通过有限稀释法连续克隆2～3次, 直至所有单个克隆细胞阳性孔率为100%时扩大培养, 进行细胞冻存和腹水制备。（3）腹水制备及纯化:每只BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡500 μL, 7 d后每只鼠腹腔接种杂交瘤细胞6×105个, 14 d左右采集腹水。SiO2吸附法对腹水进行预处理, 采用辛酸饱和硫酸铵沉淀法[4]、ProteinA亲和层析进行纯化, 紫外分光光度法测定纯化后mAb含量, 纯化后mAb过滤除菌加等量甘油, 分装-70℃冻存。 1.2.3 mAb的鉴定 （1）效价的测定: 将纯化前后的mAb倍比稀释, 以1∶200稀释的正常小鼠血清作为阴性对照, 应用间接ELISA方法测定A492, 以P/N≥2.1为阳性。（2）免疫球蛋白类和亚类的鉴定: 按操作说明将杂交瘤上清1∶200稀释, 取150 μL稀释液加入含有亚类定性试剂的试管底部, 30 s后将试纸条插入管底, 5～10 min后观察结果, 判读轻链、 重链。(3)杂交瘤细胞染色体核型分析: 生长良好的杂交瘤细胞悬液10 mL加入秋水仙素, 使其终浓度为0.1 mg/L, 继续培养3 h, 1000 r/min离心10 min, 重蒸水室温低渗处理