loading甲氨基甲基）苯酚（DMP—30）、醋酸铀染液、柠檬酸铅染液。
四、实验方法与步骤
（一）试剂配置
1. 0.2mol／L磷酸盐缓冲溶液（PBS）
A液：磷酸氢二钠·12H2O，71.64g，加双蒸水溶解至1000ml。 B液：磷酸二氢钠·2H2O，31.21g，加双蒸水溶解至1000ml。
根据不同要求，按不同配比，可得不同pH值的0.2mol／L的磷酸盐缓冲溶液，见下表：
表2-1 不同配比的磷酸盐缓冲溶液的pH值
pH（25℃） A液（ml） B液（ml）
7.0 30.5 19.5
7.2 36.0 14.0
7.4 40.5 9.5
7.6 43.5 6.5
2. 2.5％戊二醛固定液
25％戊二醛10ml，0.2mol/L PBS 50 ml，加双蒸水至100ml即可。
3. 1％锇酸固定液
（1）配置2％锇酸贮存液：取1g 安瓿四氧化锇泡酸48h，冲洗48h，双蒸水漂洗30min。干后用玻璃刀刻划1～2道痕，置入棕色磨口瓶，加双蒸水50ml，用力摇动使安瓿破碎。静置48h四氧化锇溶解后备用。4℃避光保存。
（2）配置1％锇酸使用液（现用现配）：取2％四氧化锇贮存液10ml，加0.2mol/L PBS l0ml混合。
4.不同浓度的乙醇溶液
用无水乙醇稀释成90％、80％、70％、60％、50％的乙醇。 5.环氧丙烷（必须无水）。
6.环氧树脂Epon812包埋剂（Luft配方）
Epon812，90ml；DDSA（十二烷基琥珀酸酐，软化剂），6 ml；MNA（甲基内次甲基邻苯二甲酸酐，硬化剂），5ml；DMP-30[2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚]，按2%加入。
使用时根据不同硬度要求按一定比例增减DDSA和MNA。DDSA液增多，则软；MNA液增多则硬。三种液体逐次加入混合均匀后，逐滴加入DMP-30，其浓度控制在2％。边加边搅，充分搅拌30min左右。
7.醋酸铀染液
称取醋酸双氧铀1. g,溶于50ml50％～70％乙醇溶液中，静置1～2天，使未溶的部分沉
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淀，取上部黄色透明溶液用，4℃冰箱避光保存。
8.柠檬酸铅溶液
A液：硝酸铅（必须为新近产品）1.33g，柠檬酸钠1.76g，双蒸水（用前加沸冷却）30ml，充分摇匀，混悬液为乳白色柠檬酸铅铬合物。B液：氢氧化钠（NaOH） lmol／L。
使用液：A液配制完毕30min后，加B液8ml，加双蒸水至50ml混匀，溶液清亮（pH值为10-12）。如有沉淀，不能再用。
（二）超薄切片的制备
超薄切片技术是指不需要特殊冷冻条件的常规包埋技术。包括取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色等步骤（图2-1）。
1.取材
将动物处死后，要快速取出组织，以免细胞内部细微结构发生改变。取材过程要注意以下几点：①取材部位要准确；②无人工损伤，不要牵拉、挤压，⑧样品块要小，一般切成lmm的小块，起码在某一个方向上的厚度要小于lmm，④组织离开活体后尽快（1min之内）进入预冷的戊二醛固定液中（4℃）保存。
2.固定
固定是电镜样品制备中最重要的一环，其目的是使细胞生命过程立即终止，使细胞结构和化学成分保持生前状态。电镜材料固定一般采用双重固定法，即先用戊二醛进行前固定，然后再用锇酸进行后固定。两次固定之间要进行漂洗。
（1）前固定：将取的材料立即投入预冷的2.5％戊二醛溶液中，4℃条件下固定3h。若不马上进行后面的制备程序，可保存在0.2mol/L的PBS中或2.5％戊二醛溶液固定液中（4℃）。 戊二醛的两个醛基与蛋白质、核酸等的氨基发生交链作用，可以较好地固定蛋白质、核酸和多糖等，能保存微管、糖原、核蛋白和细胞基质等，不易使酶失活，可以用于细胞化学研究，但不能固定脂类，对脂质颗粒、膜结构等保存不好。如果对保存超微结构（尤其膜系统）有较高的观察要求，经戊二醛溶液单固定的样品不宜保存过长时间，在1周内进入常规制备程序为好。2.5％的戊二醛固定液对组织的平均渗透深度为0.6mm，这是取材要小的原因之一。
（2）锇酸后固定：进行后固定以前，材料要用0.1mol／L PBS漂洗6次，每次 l0min。避免戊二醛与四氧化锇发生氧化还原反应，生成沉淀，所以要彻底洗干净。漂洗后取出，转入1％四氧化锇固定液中，4℃条件下固定1～2h。四氧化锇对氮有较强的亲和力，能与蛋白质氨基迅速结合形成交链化合物，对含蛋白质的各种结构成分均能固定。能与不饱和脂肪酸反应，生成四氧化锇二酯化合物，使含有脂类的结构固定。因为锇是一种高原子序数元素，
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在用四氧化锇固定样品的同时，还起到一种电子染色作用。但是，四氧化锇4不能固定核酸，对糖原、微管等保存不好。同时，四氧化锇又是酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究。四氧化锇固定时间太长，不仅易丢失成分，而且会使组织变脆，难切片。四氧化锇具有极强的挥发性和毒性，在任何污染和光照条件下，都可能还原成水和二氧化物而减弱固定效果，故不易长期保存。
图2-1 常规超薄切片标本的制备过程（参考Hall JL，1978） 1- 取材；2-醛类固定；3-缓冲液清洗；4-饿酸固定；5-缓冲液 清洗；6~9-脱水；10-环氧丙烷浸透；11-包埋剂浸透；12-包埋；
13-聚合；14-修块；15-超薄切片；16-染色
3.漂洗与脱水
（1）将四氧化锇固定后的材料取出，在脱水以前要进行漂洗。先用吸水纸吸干净四氧
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化锇4固定液之后，用0.1mol／L的PBS漂洗6次，每次10min。以避免在脱水时四氧化锇4与乙醇产生氧化还原反应，生成沉淀，所以要彻底洗干净。
（2）将漂洗后的材料依次放入50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇与环氧丙烷，每级15～20min，使组织中的水分充分除去。脱水剂一般用乙醇、丙酮和环氧丙烷等，利用它们具有能与水也能与包埋剂混溶的特点，以取代样品中的水分，使水分充分除去。浓度梯度脱水是为了减少样品收缩。
4.浸透
经脱水后的材料在包埋以前要经过浸透处理，即用包埋剂与脱水剂按浓度梯度分级换液，使包埋剂逐渐取代脱水剂渗透到组织中去，最终使组织细胞内所有空隙均充满包埋剂。具体操作方法：在室温下或37℃条件下将样品置入3:1的环氧丙烷与包埋剂的混合液，10～30 min；1:1的环氧丙烷与包埋剂混合液，30～60min；1:3的环氧丙烷与包埋剂混合液，1～2h或过夜；纯包埋剂，2～5h或过夜。
5.包埋
包埋的目的是让样品材料获得一定的硬度、弹性和韧性，以便制成超薄切片。操作过程如下：在包埋模具内滴一滴包埋剂，把样品置入并使之定位于合适位置（依模具而异），缓缓注入包埋剂，然后放入烤箱中进行聚合（使包埋剂固化）。控温及时间依次为：37℃，12h；45℃，12h；60℃，36h。在包埋过程中，充分浸透的样品包埋在包埋剂中，加温使包埋剂逐渐由单体聚合成高分子，样品及包埋介质获得高度的稳定性、均匀性、合适的硬度和弹性。Epon812是一种优良的包埋剂，为进口环氧树脂（epoxy resin），DDSA（dodecenyl succinic anhydride）为十二烷基琥珀酸酐，是一种软化包埋块的长链脂肪族分子；MNA（methyl nadic anhydride）为甲基内次甲基邻苯二甲酸酐，可以硬化包埋块；DMP-30为2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚，可以加速固化。
6.制备超薄切片
制备超薄切片的主要步骤有：修块（包埋块粗修）、制备玻璃刀、制备支持膜、半薄切片、修块（包埋块细修）、制备超薄切片。
（1）包埋块粗修：在对包埋样品进行超薄切片之前，先要粗修包埋块，机修、手修均可。一般可在解剖镜下先小心地把块顶端的包埋介质修去，暴露出组织，再把样品四周修成锥体形，顶面修成梯形。
（2）玻璃刀的制备：超薄切片常用玻璃刀或钻石刀。玻璃刀要用含72％～75％二氧化
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