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余液需经处理才可排放。
(2)环氧氯丙烷活化法：目前应用最广泛的活化方法，环氧氯丙烷试剂易得、偶联配基比较牢固，且价格比较便宜。该法操作简单易行，危险性相对较小。采用环氧活化法所形成的共价键稳定，配基不易脱落，活化过程中可以自动引入三个碳原子的间隔臂分子，且非特异性吸附小。环氧氯丙烷活化法是有机取代反应的机理，该反应过程是双分子亲核取代反应，当载体基质负离子游离进攻环氧氯丙烷时，环氧氯丙烷的C-O键断裂，此时，载体基质上的游离基上的O与环氧氯丙烷上的C重新形成C-O结合键。环氧活化法需在碱性条件下反应，不适用于碱敏感物质。此外，该法活化度低，载体载量小(只有溴化氰活化的几分之一)，而且偶联同时容易发生开环反应，其主要原因有：
① 环氧氯丙烷自身水解，活化反应为碱性条件下进行，碱液起到了催化的作用，但碱性时环氧氯丙烷易水解。
② 环氧氯丙烷的溶解性低，微溶于水，因此水溶液中凝胶环氧化反应程度低。
③ 环氧基高温长时间与碱液接触会生成二醇，活化反应的产物因带有环氧基，可以继续与介质上的羟基反应生成交联物，生成的交联产物有可能再与活化产物上的环氧基团反应生成更进一步的交联产物[14]。
(3)对甲苯磺酸氯活化法：主要用于活化含羟基基质，配基偶联过程中不产生新的电荷。但活化反应需在无水丙酮中进行，配基偶联简便，有机相或水相中均可进行反应。
(4)缩水甘油醚活化法：这种活化的凝胶其偶联配基密度虽然只有溴化氰活化75%，但其化学性质更稳定，配基很少脱落，分离效果好，此外此法对琼脂糖凝胶有交联作用，凝胶的刚性更好。
(5)高碘酸盐活化法等。
各种活化方法各有利弊，有的活化时间短，有的毒性低，有的形成的键稳定，可以根据不同的偶联对象和实验目的进行选择。众多学者亦对许多载体材料的活化和环氧基化做出了研究。
史清洪等[12]研究发现以二甲基亚矾为环氧氯丙烷活化溶剂可极大地提高凝胶的活化度，活化密度高达100mmol/mL以上，二甲基亚矾很好的消除了琼脂糖凝胶载体与环氧氯丙烷之间的界面现象，强化了活化反应。
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伍学勤等[15]人采用羰基二咪唑(CDI) 活化琼脂糖树脂，并用其成功制备亲和层析柱及固定化酶。
潘丹卓[16]等对琼脂糖凝胶微球活化度条件的考察发现，通过引入亲水性有机试剂二甲基亚砜，提高了Sepharose CL-6B介质环氧基活化密度。在10%体积分数的环氧氯丙烷、0.8 mol/L氢氧化钠及反应时间2.5 h的优化条件下，环氧基活化密度可达100μmol/mL以上。
沈维云[17]探索过几种合成环氧基修饰的磁性二氧化硅载体(EMS)的方法，分别是二氧化硅微球（MS）和乙烯基三乙氧基硅反应合成表面含有乙烯基的磁性二氧化硅，然后用过氧乙酸氧化双键得环氧基；用环氧氯丙烷与 MS 反应制备 EMS；用 GPTMS 和 MS 在无水甲苯中反应制备 EMS，但这三种方法键合的环氧基均未被红外光谱及化学滴定方法检出。最后，作者直接用GPTMS和四氧化三铁纳米粒反应，在温和的条件下可以在四氧化三铁纳米粒表面引入较多的环氧基，制备得到 EMS。
杨开伦等[18]用环氧氯丙烷活化2% 的珠状琼脂糖凝胶与胰蛋白酶进行偶联反应制备固定化酶。考察了固定化胰蛋白酶的活力受环氧氯丙烷量，活化反应的碱浓度及给酶量的影响。
1.4固定化酶载体的间隔臂
不溶性载体亲和纯化的空间位阻大，通常需要引入一定长度的“手臂”分子，以保证亲和配基有合适的空间取向和伸展灵活性，常用的间隔臂分子一般为小于十个碳原子且分子两端具有活性基团的小分子有机物。但对于水溶性良好的水溶性载体，其配基偶联反应为均相反应，且由水溶性载体制备的亲和载体也是水溶性的，因此配基与载体之间也是均相反应，亲和分离纯化的空间位阻小，一般不需键和间隔臂分子。合适的间隔臂要求臂长适宜兼具合适的亲水性。间隔臂太短，会存在空间位阻吸附性差，配体的空间利用率差；间隔臂太长则会产生非特异吸附，且臂易折叠缠绕，进而使有效臂长降低。此外，间隔臂的疏水性与蛋白质的疏水性相互作用，产生非特异性吸附，因此间隔臂还应有一定的亲水性。此外不同的配基需要键合的间隔臂不同，目前对于间隔臂的研究还比较少[11]。
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1.5固定化酶载体的配位体
许多学者针对特定分离系统下，对配位体的选择做出了大量的科研工作。酶的固定化及亲和纯化是利用目的蛋白质和配位体之间的选择性亲和相互作用进行分离，所以适宜的配位体是成功分离纯化生物大分子的关键。对配位体最基本的要求是性能好、稳定和价廉。通常情况下，酶的亲和纯化是从自然界存在的生物来源中选择那些与互补溶质有天然配对倾向的物质作配位体，例如：抗原、抗体、植物凝结素或酶抑制剂等，它们有很高的选择性。人们也在不断努力开发新的其他高选择性的配体如染料配位体、定位金属离子配位体、包合配合物配位体、电荷转移配位体等。
1.6 展望
（1）加强已开发载体和方法的优化并不断开发新载体、新方法来进一步提高固定化酶的活力、回收率、延长半衰期、降低成本；
（2）开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化率和生产能力，使固定化酶在工业化生产中的应用更加广泛有效[2]；
（3）充分考虑纯化量和纯度级别、酶蛋白的来源来将固定化酶工程精细化，根据用途不同及酶的性质差异合理设计不同的策略；
（4）新型分离材料、高度自动化和人工智能仪器设备的不断涌现以及蛋白质工程等分子生物学技术的引入，推动固定化酶分离化学进入了新的发展阶段。开发先进、灵活的蛋白质化学技术分离纯化天然酶、重组酶、人工模拟酶及杂合酶势在必行。随着对酶三维结构的阐明越来越多,基于分子识别可望开发出简易有效的、针对不同酶分子的专一性分离纯化技术。酶-底物、酶-底物类似物、酶-辅因子的亲和层析也是酶分离纯化中亟待开发的技术[19]。
1.7本论文研究内容及意义
亲和吸附微载体一般为粒径分布小的纳米或微米级微球，具有大比表面积，高表面活性基团，通过键和一定长度和性质的间隔臂减小亲和吸附的空间位阻，而后对生物大分子进行吸附分离。磁性高分子微球因其内部有磁性
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物质存在，在外加磁场的作用下，可快速有效地富集、分离、回收和再利用。与其它载体材料相比，磁性高分子微球作为固定化载体具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较低等诸多优点。和固定床吸附纯化蛋白质过程具有的生产能力有限，不利于连续化生产，介质微球在床层挤压中易破碎的缺点相比，磁性高分子微球能和目标分子在悬浮状态吸附结合后，利用外加磁场快捷简便地与混合物系统分离。介质载体可以反复利用。该法处理量大，利于工业放大，为规模化的蛋白质生产提供了技术支持。
本研究根据以上的技术研究意义，先采用反相悬浮包埋法制备了磁性琼脂糖微球，采用环氧氯丙烷活化法进行活化，得到环氧化琼脂糖磁性微球。并考察了活化的最优条件。为进一步在微球上结合各种不同官能团或直接吸附生物分子提供了可能，为琼脂糖磁性微球在生化分离中的应用提供了实验载体和理论基础。
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