loading储存与运输条件
试剂盒需用干冰运输并储存在-20℃非无霜冰箱中。第一次融化后，终止缓冲液和复染用甲基绿需放于室温储存，封闭缓冲液需放于 4°C 储存。然而，再次冷冻后并不明显影响这些缓冲液的使用效果。 试剂盒组分
（1）蛋白酶 K（PROTEINASE K）：2mg/ml 的蛋白酶 K 溶解在 10mM Tris溶液中（pH8.0）；用来消化细胞，增加样本的通透性。
（2）5×TdT平衡缓冲液（5X TdT EQUILIBRATION BUFFER）：1 M Sodium Cacodylate，0.15 M Tris，1.5 mg/ml BSA，3.75 mMCoCl 2 ，pH 6.6；使用前需 5 倍稀释。
（3）生物素片段末端标记反应混合物（Biotin-FragELTM LABELING REACTION MIX）：3 管；生物素标记和未标记的脱氧核糖核苷酸以最佳的比例混合，在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT酶）的作用下标记 DNA 片段末端。
（4）终止缓冲液（STOP BUFFER）：0.5M EDTA，pH8.0。
（5）封闭缓冲液（BLOCKING BUFFER）：4% BSA 溶于 PBS 溶液中。
（6）50×偶联物（50×CONJUGATE）：50×链霉亲和素标记过氧化物酶偶联物。 （7）DAB 片：HRP 底物，0.7mg/片。 （8）双氧水/尿素片：1.6mg/片。 （9）甲基绿：0.3%复染用甲基绿。
（10）HL-60 细胞阳性/阴性对照片：提供两张相似的固定细胞甩片，都是用 0.5μg/ml 放线菌素 D 处理 19 小时的 HL-60 细胞，含有已诱导凋亡细胞和未凋亡细胞，可作为凋亡阳性和阴性对照。
注意：其他组分也在使用后尽快放回-20℃冰箱保存。为了避免试剂损失，使用前可以低速短暂离心融化后的试剂，然后小心开管取用。 Materials Required but not provided
实验需用到的仪器耗材有：光学显微镜、小型染色缸、湿盒（塑料/玻璃容器与吸水纸）、冰盒、洗瓶、盖玻片、封口膜、各种规格的移液器及枪头等。
除试剂盒提供的组分外，需自备的实验试剂有：二甲苯、梯度稀释乙醇溶液（100%、90%、80%、70%）、30%过氧化氢溶液、10mM Tris溶液（pH8.0）、TBS 缓冲液（1X TBS，20 mMTris pH 7.6， 140 mMNaCl）、DNA 酶Ⅰ、1mM MgSO 4 PBS 缓冲液（选用，用于制备样本阳性对照片）、DNA酶Ⅰ（选用，用于制备样本阳性对照片）、封片剂（如Permount）等。
Precautions and recommendations
（1）TdT酶在-20℃保存时不会凝固，因此不需要提前取出融化，只需在使用前迅速从-20℃冰箱中拿出取用后立即放回保存；其他组分除封片剂外，在使用时也需放置在冰上，并在使用后尽快放回-20℃冰箱保存。为了避免试剂损失，使用前可以低速短暂离心融化后的试剂，然后小心开管取用。避免不必要的反复冻融。
（2） DAB 溶液有潜在致癌性，在操作前必须穿戴好手套、实验服和护目镜。不要吞咽。 （3） 5×TdT平衡缓冲液中含有的二甲砷酸盐有毒且潜在致癌，在操作前必须穿戴好手套、实验服和护目镜。不要吞咽。
（4）针对不同的样本类型，比如石蜡包埋组织切片，组织冰冻切片、固定细胞片等，各有不同的操作流程，请根据实验的样本类型参考相应的操作流程。对照的 HL-60 细胞片需按照固定细胞片的操作流程操作。
（5）蛋白酶 K 孵育时间，DNase I 处理时间及标记反应时间需根据细胞类型，样本制备步骤摸索最适条件。以说明书中的条件为初始参考标准。
（6）在标记反应中，推荐使用盖片或封口膜覆盖样本，保证反应液均匀分布，并避免孵育过程中缓冲液蒸发损失。准备覆盖膜时，可剪下一片Parafilm?封口膜，使其稍大于样本，并将一角折起便于在接下来实验步骤中取放。
（7）用塑料或玻璃容器及纸巾自制湿盒，在样本处理过程中使用湿盒保持样本存放环境的湿润，一定避免样本干燥 . 操作流程
A. 样本的脱蜡处理
1、室温将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡 5 分钟。更换新的二甲苯再浸泡 5 分钟以彻底脱掉石蜡。
2、室温下用 100%乙醇浸泡切片 5 分钟，更换新的 100%乙醇再浸泡 5 分钟。 3、室温下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3 分钟，逐渐增加水分。 4、用 1×TBS 轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔（Cat. #402176）在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验的每个步骤中，切勿让样品过分干燥！（如果有必要，可用 1×TBS 溶液覆盖或样本或将样本置于 1×TBS 溶液中保持湿润）处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
B. 增加样本的通透性
1、按 1：100 的比例，用 10 mMTris溶液（pH8.0）作为稀释液来稀释 2mg/ml 的蛋白酶 K 溶液，使其终浓度为 20μg/ml。每个样本需要 100μL 蛋白酶 K 溶液（可以将 1μL 的 2mg/ml 蛋白酶 K 溶液加至 99μL 的 10mM Tris溶液中配制而成）。
2、每个样本上滴加 100μL 浓度为 20μg/ml 的蛋白酶 K 溶液，使其被全部覆盖，室温孵育 20 分钟（不能过分孵育）。注意严格控制孵育时间, 孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害；过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。蛋白酶K 工作液的使用浓度、处理时间及温度因组织或细胞的类型或固定方法的不同而有所不同，使用者可参照试剂盒提供的标准使用说明摸索最合适的实验条件。 3、用 1×TBS 溶液润洗样本。
4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。 C. 样本阳性/阴性对照处理
为选做，可根据自身情况分析选做。但试剂盒提供的 HL-60 细胞的阳性/阴性对照片建议操作。
1、取经过预处理（已完成通透性处理）的组织包埋切片，用含有 1μg/μl 的 DNA 酶Ⅰ（Cat. #69164）溶液（含有 1mM MgSO 4的 1×TBS 溶液）完全覆盖样本，室温孵育 20 分钟。 2、用 1×TBS 溶液漂洗。
3、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持其湿润。
D. 灭活内源过氧化物酶活性
1、1：10 稀释 30% H 2 O 2溶液（将 10ul 30% H 2 O 2与 90ul 甲醇混合，每个样本需 100ul 这样的混合物）。
2、以上述制备的 100ul 3% H 2 O 2溶液完全覆盖样品，室温孵育 5 分钟。处理时间不可过长。
3、用 1×TBS 缓冲液漂洗。
4、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。 E. 平衡和标记反应
1、按 1：5 的比例用蒸馏水稀释 5×TdT平衡缓冲液（每个样本需用 20μl 5×缓冲液和 80μl 蒸馏水混合稀释成 100μl 缓冲液）。
2、滴加 100μl 1×TdT平衡缓冲液使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育 10-30 分钟。或者
将载玻片放入一个含有 1×TdT平衡缓冲液的缸中，保证缓冲液没过样本。在等待孵育的同时准备标记反应混合物。
3、把TdT酶从冰箱中取出，为了减少试剂损耗，在打开管盖前需短暂离心试管。将置于冰上的洁净离心管一一做好标记，用移液器准确加入 57μl 生物素片段末端标记反应混合物（Biotin-FragELTM LABELING REACTION MIX）和 3μl TdT酶（TdT ENZYME），轻轻吹打混匀备用。阴性对照的标记反应混合物中不加TdT酶，而用蒸馏水替代。 4、轻轻吸干样本周围的 1×TdT平衡缓冲液，注意不要触碰到样本。 5、在每个样本上立即滴加 60μl 上述准备的TdT标记反应混合物。
6、用预先裁剪好的比样本稍大的Parafilm?封口膜覆盖样本。注意：可将封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不仅可以确保反应混合物的均匀分布，也能减少孵育过程中的液体蒸发。
7、将切片置于湿盒中于 37℃孵育 90 分钟。 F. 终止标记反应
1、如果终止缓冲液中有沉淀，在使用前将其置于 37℃预热 5 分钟。 2、移走Parafilm?封口膜，并用 1×TBS 溶液中漂洗。 3、每个样本上滴加 100μl 终止缓冲液，室温孵育 5 分钟。 4、用 1×TBS 缓冲液漂洗。
5、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。 G．．．．显色与检测
1、每个样本上滴加 100μl 封闭缓冲液，室温孵育 10 分钟。
2、用封闭缓冲液 1：50 稀释 50×偶联物（每个样本需用 2μl 50×偶联物和 98μl 封闭缓冲液混合稀释成 100μl 缓冲液）。
3、小心吸去样品上的封闭缓冲液，注意不要接触到样品。并立即加入 100ul 稀释过的 1×偶联物。
4、将切片置于湿盒中于室温孵育 30 分钟。
5、孵育结束前 5 分钟，制备 DAB 显色物溶液：将一片 DAB 片和一片双氧水/尿素片溶于 1ml 自来水（足够处理 10 个样品）。注意：自来水中可能含有金属离子，造成 DAB 显色增强。
6、用 1×TBS 缓冲液漂洗。
7、轻轻去掉多余液体，小心干燥样品周围的玻片部分。
8、每个样本上滴加 100μl DAB 显色物溶液，室温孵育 10-15 分钟。 9、用dH 2 O 漂洗样本。 H．．．．复染
1、立即以 100ul 甲基绿复染剂完全覆盖样品。 2、室温孵育 3 分钟。
3、将玻片一边置于吸水纸上吸去绝大部分复染剂，并放置于科普林缸。 4、将玻片浸于 100%乙醇中 2-4 次。 5、用吸水纸吸去玻片上液体。 6、重复第四步，换用新鲜乙醇。 7、用吸水纸吸去玻片上液体。 8、将玻片浸于二甲苯中 2-4 次。
9、擦干玻片背部及样本周围部分的二甲苯。 10、盖上盖玻片，以封片剂如Permount封片。