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氧化型低密度脂蛋白对骨髓内皮前体细胞增殖、凋亡及NO分泌功能的影响(1)
】 目的： 探讨氧化低密度脂蛋白（oxLDL）对骨髓内皮前体细胞（EPCs）增殖、凋亡及一氧化氮(NO)分泌功能的影响. 方法： 密度梯度离心法获得猪的骨髓EPCs，不同浓度oxLDL(B组5 mg/L，C组10 mg/L，D组20 mg/L）作用于EPCs，MTT法检测oxLDL对EPCs增殖能力的影响，流式细胞仪检测oxLDL对细胞的凋亡率的影响，硝酸还原酶法检测细胞培养液中NO含量的变化，观察oxLDL对细胞及其功能的影响. 结果： 与对照组相比，oxLDL抑制EPCs增殖（B组0.189±0.007，C组0.112±0.008，D组0.070±0.008）（n=8)，促进EPCs的凋亡（B组18.35±0.08，C组24.22±0.07，D组40.37±0.13） （n=6），损伤细胞的分泌功能，作用随oxLDL浓度增大而增强(P<0.001). 结论： OxLDL抑制EPCs的增殖，损伤细胞分泌功能，促进细胞凋亡，与临床上观察到的冠心患者EPCs数量减少可能有一定的关系.
【关键词】 内皮祖细胞；脂蛋白类，LDL；一氧化氮 0引言
成体动物及人的外周血、骨髓中存在有内皮前体细胞（EPCs），它们是以CD133, flk1, CD31, Ⅷ因子［1-2］为标志的一群细胞，可以迁移、增殖并分化为成熟的内皮细胞，促进内皮的修复及出生后新生血管化的形成［3］. 新生血管化的形成可以改善心肌供血,并且阻止心肌梗塞区域疤痕组织的进一步形成［4］，从而改善心脏功能. 大量的研究已经证实，骨髓来源的EPCs有诱导缺血组织新生血管形成的潜力. 相反,高脂血症损伤新生血管和供应缺血区组织血运的侧支血管的形成. 氧化低密度脂蛋白(oxLDL)在动脉粥样硬化的形成过程中起着重的作用，我们研究oxLDL是否影响内皮前体细胞的增殖、凋亡及细胞功能，从而间接了解oxLDL对新生血管化的形成有何影响. 1材料和方法
1.1材料雄性中国小型猪2只，体质量（40±5） kg，由我校实验动物中心提供； PBS, Ficoll淋巴细胞分离液，胎牛血清（Gibco，美国），DMEM（Gibco，美国），VEGF及bFGF（AustraliaTBD Science，澳大利亚），10万U青霉素和100 mg/L链霉素，小鼠flk1、山羊属CD133（Santa Cruz，美国）、鼠CD31, FITC羊抗小鼠（IgG）、FITC羊抗兔（IgG）、罗丹明兔抗羊（IgG）（Zymed，美国）， NO, TBA试剂盒（南京建成，中国），LDL
（Sigma，美国）， 6孔培养板（Nunclon，丹麦）; Elite ESP流式细胞仪(美国COULTER公司)，Olympus Tokyo CK相差显微镜（奥林巴斯），DG3022A型酶
联免疫检测仪（南京华东电子管厂），UV2450分光光度计（日本SHIMADZU公司），MRC1024激光共聚焦显微镜（美国BioRad公司）.
1.2方法
1.2.1猪骨髓单核细胞的分离30 g/L浓度苯巴比妥1 mL/kg麻醉后，左侧髂后棘局部常规消毒铺巾，20 g/L利多卡因5 mL局麻，沿髂后棘行骨穿，有落空感后接肝素化的20 mL注射器用力抽吸. 抽出的细胞悬液经等体积DMEM混合重悬后，小心叠加于等体积淋巴细胞分离液上，保持界面清晰，2000 r/min, 离心20 min，吸取中间云雾层细胞，5倍体积DMEM重悬，1500 r/min, 10
min，洗涤两次. 末次离心后，弃上清，加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM重悬. 取微量细胞悬液与等体积2 g/L台盼蓝染液混合，进行细胞活力计数，死细胞被染成蓝色，活细胞不着色，活细胞数占98%以上. 细胞接种于培养瓶中，由于成纤维细胞贴壁较快，多于24 h内贴壁，故取24 h未贴壁细胞，经含100 mL/L胎牛血清、VEGF（10 μg/L）, bFGF（10 μg/L）的全培养液重悬后接种培养；部分细胞接种于铺有盖玻片的24孔板中，细胞爬片48 h后进行鉴定.
1.2.2氧化低密度脂蛋白的制备低密度脂蛋白（LDL）购于Sigma公司，经PBS溶解后，与灭菌的CuSO4溶液（5 μmol/L）, 37℃孵育24 h. 对照含200 μmol/L EDTA无CuSO4同样条件孵育. 孵育中止后，氧化的LDL加EDTA至终浓度0.6 mmol/L中止氧化，在含200 μmol/L EDTA 的PBS溶液中透析24 h. 丙二醛的生成表明LDL被氧化，用TBA法检测丙二醛的生成. OxLDL中TBA浓度为（14.74±0.55） mmol/kg.
1.2.3实验分组细胞80%长满后，2.5 g/L胰蛋白酶消化，全培养液重悬呈单细胞悬液后，接种于96孔板及24孔板. 贴壁后，取对数生长期细胞分组： A组(对照组)加等量含200 μmol/L EDTA的全培养液；B, C, D组分别给予含oxLDL浓度为5, 10及20 mg/L的全培养液，37℃ 50 mL/L CO2孵箱孵育. 96孔板细胞孵育24 h后，每孔加MTT 5 g/L, 37℃继续孵育4 h，终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入150 μL的DMSO后振荡10 min，酶联免疫检测仪，490 nm波长测各孔A值. 细胞培养24 h后，各取100 μL细胞培养液，用硝酸还原酶法测NO的分泌量，使用南京建成NO试剂盒，方法见说明书；24孔板培养细胞在oxLDL作用72 h后，2.5 g/L胰蛋白酶（含2 g/L EDTA）消化细胞中止后，送流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率.
作者：宗小娟，王海昌，周祥，程康 【关键词】内皮祖细胞Effect of oxidized lowdensity lipoprotein on prolifer
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1.2.4细胞鉴定激光共聚焦：细胞爬片48 h后，40 g/L多聚甲醛固定30 min后，PBS冲洗3次，干燥后分别按1∶75稀释flk1和CD133的一抗，及CD31和CD133的一抗进行双标，4℃冰箱，湿盒过夜后，吸除剩余的一抗，PBS冲洗后分别加入1∶100稀释的二抗进行双标，置入4℃冰箱，湿盒过夜，PBS冲洗后行激光共聚焦检测，结果见图1，2.
图1CD31和CD133（略） 图2flk1和CD133（略）
1.2.5数据处理与统计分析对实验组和对照组数据求其平均值和标准差，应用SPSS13.0进行数据统计，所用统计方法为方差分析，多重均数差异显著性检验采用LSDt检验.
2结果
2.1OxLDL对细胞增殖的影响经oxLDL作用24 h后，骨髓源性的EPCs的增殖能力与对照组（0.260±0.010）相比，不同浓度的oxLDL对EPCs增殖均有明显抑制作用，B组（0.189±0.007），C组（0.112±0.008），D组
（0.070±0.008），且随浓度增加而抑制作用增强，两两之间比较差别均有统计学意义，P均<0.001 (n=8).
2.2流式细胞仪检测oxLDL对细胞凋亡的影响有文献报道EPCs本身就存在有自身凋亡的现象，在本实验中观察到72 h后对照组EPCs凋亡率为
12.68±0.06，与对照组相比，不同组浓度的oxLDL对EPCs均有促凋亡作用，B组（18.35±0.08），D组（40.37±0.13），C组介于B, D组之间
（24.22±0.07），以D组更为显著，不同浓度的oxLDL促凋亡作用组间差异均有统计学意义（P＜0.001），且随浓度增高而促凋亡作用增强(n=6). 2.3NO分泌量NO是一种有多种生物活性的物质，在心血管系统有许多重的生理作用，其化学性质活泼，在体内代谢很快；NO分泌量是内皮细胞功能的标志，内皮功能障碍通常表现为NO分泌量的减少. 与对照组（176.33±0.74） μmol/L相比，不同浓度的oxLDL均可损伤EPCs的NO分泌量，随oxLDL浓度的增加，NO分泌量呈不同程度的减少，B组（159.10±0.19） μmol/L, C组