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（6）滴定管 （7）称量瓶 （8）移液管 （9）电炉 4 测定步骤 4.1 斐林试剂的标定
吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加10毫升水，并从滴定管中预先加入约20毫升0.1%标准葡萄糖溶液(其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄搪溶液1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4~5秒钟1滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完成，总耗糖量为V0毫升。 4.2 定糖
预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加入V1毫升试样稀释液(含葡萄糖量约为5~15毫克)及适量的0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V2毫升。
正式试验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加V1毫升试样稀释液和(V2-1)毫升0.1%标准葡萄糖溶液，补加[(V0+10)-(V1+V2)]毫升水，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V毫升。
重复测定两次，取总消耗标准葡萄糖液体积的平均值V ml。
5 计算
还原糖（以葡萄糖计%）?（V0?V）?C?n?1V1?100%
式中 V0：斐林试剂标定值(毫升) V：斐林试剂测定值(毫升) C：标准葡萄糖溶液浓度(克/毫升) n：试样稀释倍数
v1：所取试样稀释液体积(毫升) 6 说明
(1)滴定速度、三角瓶壁厚度和热源的稳定程度等，对测定精密度影响很大。平行测定的滴定毫升数相差不应超过0.1ml，故在标定、预备、正式测定过程中，实验条件应力求一致。
(2)滴定过程应该始终保持在微沸状态下进行。沸腾后继续滴定至终点的毫升数应控制在0.5~lml内，
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否则应重新测定。
(3)样品液中还原糖浓度不宜过高或过低，根据预备试验结果，应将样品液稀释至还原糖的含量在1%左右为宜。
(4)滴定至终点蓝色褪去之后，就不应再滴定，因四甲基蓝指示剂被还原褪色后，当接触空气时，又会被氧化重现篮色。
(5)斐林溶液与还原糖之间的反应因受溶液碱性、加热湿度和时间以及副反应等影响，而没有严格的定量关系，不能由当量定律来求出试样中还原糖的含量，只熊根据在相同实验条件下消耗相应的标准还原糖量或由严格相同的实验条件下得出的还原糖检索表上查得相应的还原糖量来进行计算。所以用廉-爱农法定糖时，必须先用相应的标准还原糖标定斐林溶液。 7 参考书
（1）天津轻工业学院等，《工业发酵分析》，轻工业出版社，1980年
玉米淀粉液化及糖化
1 实验目的及要求
要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。掌握粗淀粉含量和还原糖的化学测定方法。
2 实验原理
发酵过程中，有些微生物不能直接利用淀粉，因此，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液称为淀粉水解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液的质量，与生产菌的生长速度及产物的积累直接相关。 可以用来制备淀粉水解糖的原料主要有薯类(木薯、甘薯)淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，水解淀粉为葡萄糖的方法可分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室中常采用酶解法制备淀粉水解糖。
酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第l步是利用α-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。 2.1 酶法液化原理
淀粉的酶法液化是以α-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的α-1,4糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，其碘色反应发生如下变化：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。
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酶法液化以生产工艺不同分为间歇法，半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合法。本实验采用：高温酶法，间歇式，罐式，二次加酶法。 2.2 酶法糖化原理
淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的α-1，4糖苷键或α-1，6糖苷键。因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。 淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中，水参与反应，故糖化的理论收率为111.1％。 （C6H10O5)n+H2O nC6H12O6 162 18 180 淀粉糖化实际收率： 实际收率的计算公式：
收率?糖液量(L)?糖液葡萄糖含量(%)?100%投入淀粉量?原料中纯淀粉含量淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。 淀粉转化率的计算：
转化率?糖液量(L)?糖液葡萄糖含量投入淀粉量?原料中纯淀粉含量(%)?1.11?100T值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的百分比称为DE值。
DE值计算：
DE值?还原糖含量（%）?100%干物质含量（%）还原糖用裴林氏法或碘量法测定，浓度表示：葡萄糖g/100ml糖液； 干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质g/100g糖液。 影响DE值的因素：
糖化时间：最初糖化时，糖化速度快，DE值显著上升；但24h后，当DE值达到90％以上时，糖化速度显著放慢。
液化DE值与糖化DE值的关系：
液化程度应控制适当，太低或太高均不利。原因是液化程度低，则粘度大，难操作；同时，由于液化程度低，底物分子少，水解机会少，影响糖化速度；液化程度低，易发生老化；但液化超过一定程度，则不利于糖化酶与糊精生成络合结构，影响催化效率，造成糖化液的最终DE值低。故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，则糖化液的最高DE值越高。一般液化DE值应控制在12-18％。
酶制剂用量与糖液DE值的关系：
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糖化时间与糖化酶用量关系表 糖化时间（h） 糖化酶用量（U/g淀粉） 6 480 8 400 10 320 16 240 24 180 32 150 48 120 72 100 为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终导致葡萄糖值降低。在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。
糖化酶参考用量：液化DE值17％，淀粉乳33％，60℃，pH4.5，酶制剂240U/g绝干淀粉。糖化时间16h。
3 实验仪器、设备和材料
（1）25升罐
（2）小型板框过滤机压滤 （3）烘箱 （4）水桶 （5）量筒 （6）分光光度计 （7）水浴锅 （8）滴定管 （9）电炉 （10）白瓷板 （11）三角瓶 （12）阿贝折光仪 （13）玉米粉 （14）高温α-淀粉酶 （15）糖化酶 （16）pH试纸
4 实验步骤
4.1 淀粉的液化
配制30％的淀粉乳（按15升配制），调节pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2％)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min，再加热至90℃，并维持30min，以达到所需的液化程度(DE值：15-18％)，碘反应呈棕红色（淀粉受到α-淀粉酶的作用后，遇碘呈
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